支气管扩张症动物模型研究进展

田 丽 张少言 吴显伟 邱 磊 刘希芳 吴定中 张惠勇 鹿振辉

上海中医药大学附属龙华医院呼吸疾病研究所，上海 200030

支气管扩张症是由慢性气道损伤引起支气管管壁肌肉和弹力支撑组织破坏导致的支气管不可逆扩张[1]，临床表现为慢性咳嗽、咳痰和反复的支气管感染。有研究显示，我国7 个省市城区40 岁以上人群支气管扩张症患病率为1.2%[2]，英美等国家也呈现出较高的发病率和死亡率[3-4]。支气管扩张症原因多为支气管感染和阻塞两大类，研究表明支气管扩张症患者存在上皮异常重塑伴黏膜纤毛结构受损，导致炎症和感染[5]，炎症和感染又可导致支气管上皮细胞肿胀、脱落、坏死，黏液分泌增多，黏液腺增生，支气管管壁结构破坏，发生支气管扩张症，产生恶性循环。但是由于缺乏适宜开展研究的动物模型，其病理机制尚未完全清楚，故使用适合的动物模型进行基础研究对阐明其发病机制、研发新的治疗药物至关重要。既往我国基础研究多采用大鼠气管内直接注射铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染的方法建立支气管扩张症模型[6-7]，本文新增细菌感染/纤毛基因缺失小鼠和呼吸道类器官模型，以供本病研究参考。

1 细菌感染支气管扩张症模型

支气管扩张特征是炎症、支气管壁破坏和慢性细菌感染[8]。PA 是支气管扩张症患者气道中检测到的最常见的细菌[9]。1989 年Lapa 等[10]通过结扎大鼠肺叶顶叶并向支气管内注射PA 建立了世界上首例大鼠支气管扩张症模型，之后，有研究者采用皮下气囊内注射PA 弹性蛋白酶建立大鼠炎症气囊模型[11]。2000 年万毅刚等[12]将Lapa 模型改进为支气管内直接注射PA，近20 年来我国的支气管扩张症研究大多采用该法构建动物模型。但大鼠体积大，饲养管理及实验操作不方便，不利于研究的大规模长期开展，同期国外研究多采用小鼠模型直接接种[13]，或用琼脂珠、琼脂糖珠等包被菌株，使菌株入肺率和感染成功率增加，为支气管扩张症的研究提供了更多可选择的模型。

1.1 PA 肺部感染小鼠模型

C57BL/6 小鼠麻醉后进行气管插管，将菌量为5×107CFU 的含藻酸盐PA 滴入气管内感染，建立小鼠肺部感染模型[14]，该研究发现感染后肺的黏弹性可作为评估小鼠模型中PA 感染严重程度的新生物标志物。该造模方法引起的肺部感染可持续72 h 以上，为研究PA 与支气管扩张症的相互作用机制提供了一个合适的模型。

也有研究将PA[（1×106～2×106）/50 μl]用琼脂珠包埋后进行气管内注射建立慢性感染小鼠模型[15-16]。细菌培养后将其重悬于磷酸盐缓冲液中，加入融化的胰酪大豆胨琼脂培养基（50℃）中，再于重矿物油中在室温下高速搅拌，最后缓慢冷却琼脂固化形成珠，使混合物中的细菌嵌入琼脂珠中，磷酸盐缓冲液洗涤后得到琼脂珠悬浮液。该模型可维持3 个月以上的细菌定植。该模型小鼠肺损伤（细菌斑块百分比）增加；支气管和肺实质有炎症病变[17]，炎症小体在支气管扩张中过度激活。

有研究采用琼脂糖珠包被PA 制备肺部感染模型[18]。将1 ml 菌株悬浮液与8.5 ml 50℃预热的2%琼脂糖和0.5 ml 印度墨水（以便在组织中观察琼脂糖珠）混合后将其加入重矿物油，平衡、搅拌、冷却、离心，磷酸盐缓冲液稀释得适宜浓度的琼脂糖珠，经气管插管滴入50 μl PA[19]。PA 感染模型（5×105CFU/只）可引发小鼠支气管周围淋巴新生，为研究支气管扩张症中淋巴聚集的发展及其持久性所涉及的细胞和分子机制提供了一个独特的模型。此外，该模型可在组织中观察到琼脂糖珠，使得感染部位和数量直观化，便于进一步的研究。

此外，还有经鼻单次接种及雾化吸入PA[20]的方法来制备PA 肺部感染小鼠模型。PA 与其他细菌比较，其感染对支气管扩张症的不良影响更大[21]，以上造模方法为研究PA 慢性感染在支气管扩张症中的病理机制及其产生的炎症表现提供了多个可选择的模型，可成功模拟肺部慢性感染，但操作要求较高，通过手术气管插管滴注珠悬液，需要注意切口引起的感染。

1.2 脓肿分枝杆菌肺部慢性感染小鼠模型

非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）与支气管扩张症密切相关。美国支气管扩张研究登记处发现，63%的支气管扩张症患者有NTM 病史或NTM 隔离史[22]，NTM 患者更有可能出现弥漫性气道扩张和树芽征。一项队列研究纳入221 例支气管扩张症张患者，研究期间有15.8%检测到了NTM[23]。人NTM 肺病主要由鸟分枝杆菌复合群、NTM 等引起。近年来，由NTM 引起的肺部感染有所增加，尤其是患有基础肺部疾病，如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病等患者，因此建立NTM 肺部感染小鼠模型对研究支气管扩张症与NTM 的关系至关重要。

气管插管注射包埋有NTM 菌株的琼脂珠悬液悬液（1×105CFU/50 μl）来制备NTM 肺部感染模型，苏木精-伊红染色显示存在淋巴细胞和少量中性粒细胞[24]，并产生肺损伤的表现。该造模方法可造成持续长达两个月的肺部感染，与在支气管扩张症合并NTM患者中观察到的损伤相类似，可克服NTM 清除和模拟人类囊性纤维化、支气管扩张等，可用于进一步研究支气管扩张症合并NTM 感染的发生发展机制及两者关系，有助于临床诊断。

1.3 粘滑口腔球菌肺部感染小鼠模型

纳入182 例支气管扩张症患者的队列的支气管肺泡灌洗液中发现，9%的患者下呼吸道中定植了粘滑口腔球菌。为探讨粘滑口腔球菌对支气管扩张症的潜在致病性，研究者建立了一种粘滑口腔球菌肺部感染的小鼠模型[25]，将其使用琼脂包被后气管插管滴入，96 h 后肺组织和肺泡灌洗液中出现大量中性粒细胞浸润，并产生促炎性细胞因子、趋化因子和脂质介质，环氧化酶-2 增加。该模型的建立为研究支气管扩张患者的细菌学和个体化微生物组提供了新的见解，并首次提示了粘滑口腔球菌在支气管扩张患者中的致病作用。

综上所述，PA、NTM 等微生物感染气道会刺激和维持以中性粒细胞性炎症为主的肺部炎症。但目前对于中性粒细胞以外的炎症细胞的作用机制研究很少，因此亟需适合的动物感染模型来进行相应的基础研究，进一步阐明微生物在支气管扩张症中的发病机制，进而指导临床研究与治疗。以上多种小鼠感染模型适用于研究PA 等相应的微生物感染所导致的支气管扩张症发病机制，为研究相应的菌株与支气管扩张症之间的关系及后期的治疗提供了适合的模型，有利于进一步明确支气管扩张症产生的相关机制。造模方法操作较简便，动物与菌种均容易获得，可产生与人体感染导致的支气管扩张症相同的细菌定植和相似的肺部感染，但是存在无法短期内造成支气管扩张的形态表现及气管切开插管易感染的缺点。

2 纤毛基因缺失支气管扩张症小鼠模型

支气管扩张症是一种与黏液纤毛清除功能受损相关的病理性气道扩张综合征。除感染外，黏液-纤毛功能障碍、α1-抗胰蛋白酶缺乏等遗传性缺陷均可使支气管管腔阻塞[26]，导致支气管扩张。原发性纤毛运动不良症为常染色体隐性遗传疾病，该病患者的支气管纤毛存在动力臂缺失或变异等结构异常，导致纤毛不动或运动障碍，引起气道纤毛清除功能的丧失或缺陷，产生慢性炎症，进一步发展为破坏性气道疾病（支气管扩张）。故正常的纤毛对清除气管异物、分泌黏液及保持支气管通畅发挥着重要的作用。许多学者根据纤毛的这一特性，探讨并应用纤毛功能障碍或纤毛基因缺失建立支气管扩张症小鼠模型进行研究。

常染色体显性遗传多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）与支气管扩张症患病率增加有关。ADPKD 是一种纤毛疾病，涉及肾上皮细胞中非运动纤毛结构和功能所必需的基因发生突变。在ADPKD 小鼠模型中发现有鞭毛内运输分子IFT88 基因的缺失，而IFT88 基因是鞭毛内运输机制的一个重要组成部分。为此建立IFT88 基因敲除小鼠，探讨该基因的缺失是否可导致支气管扩张症的发生[27]。结果显示IFT88-/-小鼠纤毛运动减慢和气道高反应性增加，3 周时IFT88-/-小鼠中有部分气道有明显扩张，3 个月时其出现明显的支气管扩张。由于IFT88 的敲除，气道纤毛的缺失使气道的结构和功能发生异常，导致非炎症支气管扩张和气道高反应性。

核蛋白Chibby（Cby）是Wnt/β-catenin 的拮抗剂，Wnt/β-catenin 信号通路在肺形态的发生、再生、修复等各个方面起着至关重要的作用。典型的Wnt 信号通路利用核β-catenin 作为转录激活因子，通过与转录因子的T 细胞因子/淋巴增强因子家族结合来激活基因表达从而发挥作用。而β-catenin 信号的持续激活可破坏上皮细胞的分化，导致周围气道扩张。Cby 可抑制β-catenin 靶基因激活。为此建立Cby 基因敲除小鼠探讨其与肺功能、肺发育及支气管扩张症等的关系[28]。研究表明，靶向破坏Cby 基因可使β-catenin靶基因cyclin D1 和axin2 在Cby-/-小鼠肺中上调。β-catenin 这一特异性的激活使得气道扩张，气道上皮分化异常，导致肺的结构和功能的异常，表现为肺泡数量减少、肺上皮细胞增殖减少、分化受损及气道扩张。该基因缺陷小鼠模型的建立可为支气管扩张症的研究提供有价值的动物模型。

瞬时受体电位多囊蛋白-2（transient receptor po tential polycystin-2，TRPP2）由平滑肌Pkd2 基因编码，该基因的突变可导致ADPKD，可出现影像学和临床表现的支气管扩张。因此，使用Pkd2 基因条件敲除（Pkd2 conditional gene knockout，Pkd2SM-CKO）小鼠来研究TRPP2 缺乏是否可以导致与ADPKD 相关的支气管扩张症[29]。苏木精-伊红染色表明Pkd2SM-CKO小鼠产生气道扩张表现。通过收缩和舒张气管平滑肌药物干预，还发现Pkd2SM-CKO小鼠支气管平滑肌张力下降。该基因敲除小鼠模型的制备为调节支气管平滑肌张力提供了一个潜在的治疗靶点，为ADPKD 并发症及呼吸疾病，特别是支气管扩张症的治疗提供新的思路。

综上，纤毛基因缺陷小鼠支气管扩张症造模稳定，与纤毛功能相关的基因种类多样[30]，且CKO 小鼠为目前研究常用的方法，可直接观察目的基因对支气管扩张症的影响，适用于研究特定基因与支气管扩张症产生关系的机制研究，但是具有实验周期较长、敲除技术要求高、价格昂贵等缺点。此外还有纤毛基因缺乏导致原发性纤毛运动障碍的基因缺陷小鼠模型，但由于实验时间限制，这些基因缺陷是否最终会导致支气管扩张症仍需要进一步的研究与观察，但不可否认这些为未来更多基因缺陷支气管扩张症小鼠模型的建立提供了选择。

3 呼吸道类器官模型

近年来许多系统的三维类器官模型的建立使基础研究有了较动物模型与人体组织更加相近的体外模型，这些类器官来源于人干细胞或器官特异性祖细胞，其显示出与人体器官一致的结构和功能，可广泛应用于疾病造模、药物药理等[31]。

3.1 人肺类器官

激活蛋白A 的有效诱导可将人多能干细胞分化为前肠球状体，再通过调节成纤维细胞生长因子和hedgehog 信号将前肠内胚层诱导为肺谱系，最后建立人肺类器官。人肺类器官由肺的上皮细胞和间质细胞组成，具有近端气道样结构，其结构特征与天然肺相似[32]。RNA 测序后表明该类器官与人胎儿的肺部非常相似。人肺类器官模型的建立为研究人肺发育、成熟和肺部疾病提供了一个很好的模型，也为研究支气管扩张症在人肺类器官模型的应用提供了基础和借鉴。

人肺类器官的建立还可通过Wnt 信号通路的周期性调节[33]，从多能干细胞高效衍生出功能性人气道上皮细胞，最后建立人肺类器官模型来研究肺部气道疾病。Wnt 信号可通过NKX2-1+祖细胞中间体快速定向分化为功能性近端气道类器官[34]。该类器官模型结构包含多种气道上皮细胞，且其气道标志物水平显示与成人肺相当。该模型适用于多种气道遗传性疾病的体外建模和药物开发，故也可以应用于支气管扩张的相关研究。

3.2 气液界面（airliquid interface，ALI）组织培养

ALI 组织培养通过从肺移植物中获得人支气管上皮细胞进行培养，使用PneumaCul 培养体系在气-液界面促进细胞的增殖和分化[35]。气管切片使用含二硫苏糖醇和DNAse1 的MEM 冲洗，然后在含链霉亲和素、DNAse1、抗生素和抗真菌剂的MEM中过夜孵育。上皮细胞片用细胞消化液进一步解离，并置于PneumaCult Ex-Plus 扩增培养基，传代后使用含特殊条件培养基的平板建立ALI，分化4～6 周为成熟的ALI。气液界面组织培养是体外产生呼吸上皮细胞成熟的模型，该模型可保留人体呼吸道上皮细胞的特征，高度模拟人呼吸道结构。

综上，类器官模型应用人源性的组织进行实验研究，可高度模拟人体内环境和疾病演变过程。除了与人体器官组织形态、基因更加相似，还在实验过程中排除了动物模型可能发生的变量，且与单一的细胞培养比较，更能代表复杂的人体组织，是目前研究的热点和方向。但是类器官培养需要较高的技术和实验条件，目前国内尚未大规模应用，此外类器官虽然能模拟人体器官结构，但只是单个或部分结构，不能反映人体整体情况。但相较动物及细胞模型来说，更符合人体内环境，是支气管扩张症等呼吸系统疾病未来研究的方向。

4 总结

支气管扩张症是一种常见的慢性呼吸道疾病，易与其他呼吸系统疾病相互影响，相互重叠，为其诊断及治疗带来困难。气道的微生物感染和纤毛功能障碍等所导致的支气管阻塞是支气管扩张症产生的主要原因。但是受限于动物模型的制备，其发病机制尚未完全清晰，对其药物研发也造成极大的困扰。既往支气管扩张症的各种动物模型种类较少，且尚未有国际标准的支气管扩张症动物模型造模方法，需要进一步的深入研究与细化。近年来逐渐出现纤毛基因缺失及人肺类器官等模型，为支气管扩张症等呼吸系统疾病的研究提供了新的方法，有助于进一步阐明本病机制及药物作用，是未来支气管扩张症基础研究的方向。