左旋多巴对帕金森病大鼠神经行为学影响的剂量差异和时间差异

吴家乐

（中南大学湘雅医院，湖南 长沙，410000）

左旋多巴（L-dopa）是对症治疗帕金森病（Parkinsons’disease）的最有效药物，但是，随着用药时间的延长，患者会出现许多运动并发症，比如异动症、症状波动等，对于PD患者而言，是一种疗效方面的严重打击，更是患者心理防线的重击，生活质量也因此直线下降[1]。几项动物实验的结果发现，左旋多巴在长时间使用后，PD大鼠会出现异常不自主运动（abnormal involuntarymovemen，AIM），而PD大鼠的药效期也明显缩短[2-4]。在本次研究中，采用经典PD动物模型，探讨了不同剂量左旋多巴和不同持续用药时间下大鼠的异常不自主运动情况，包括前肢、口面部、轴性和旋转AIM4个维度，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

健康SD雌性大鼠60只，体重区间为180-200g，清洁级，维持12h光照/12h黑暗的标准光照周期，自由摄取食物和水。6-羟基多巴、阿扑吗啡、左旋多巴甲酯、苄丝肼、维生素C、大鼠脑立体定位仪。

1.2 大鼠模型制备

制作PD大鼠的模型，首先，对大鼠腹腔内注射氯胺酮进行麻醉，剂量为1.25ml/kg，按照平颅头位把大鼠固定在脑立体定向仪的特定位置。将头部毛发剔除干净，取碘伏给予皮肤表面消毒，随后，找准正中线的位置，下刀切开头皮，利用15%双氧水灼烧骨膜，暴露颅骨缝、前囟，准确定位前囟坐标，以《大鼠脑立体定位图谱》为标准，将右侧前脑内侧束的坐标明确下来：（1）前囟后3.7mm，矢状缝右侧1.7mm，颅骨下8.0mm，门齿线-2.4mm。（2）前囟后4.4mm，矢状缝右侧1.2mm，颅骨下8.0mm。门齿线-2.4mm。

根据上述的坐标下钻获得钻孔，用微量注射器（10uL）取6-羟基多巴6uL（溶于0.2%维生素C生理盐水，浓度为4ug/uL）进行注射，每点3uL，注射速度控制在1uL/min，药物推注后留针5min再行退针，注意缓慢退出，针头退出4mm后仍然要有5min的留针，保证针头逐步完全退出，药液外溢的问题得到解决。注射完毕后，将切口缝合，将大鼠放回笼内，正常喂养。

3w后，大鼠需接受阿扑吗啡0.5mg/kg腹腔内注射诱导旋转，观察30min内旋转圈数，频率达到7次/min以上为模型制作成功。

1.3 分组

准备不同剂量左旋多巴对大鼠模型进行腹腔注射，在连续3d接受阿扑吗啡诱导后，对PD大鼠进行分组，按照剂量差异作为划分标准，分别为小、中、大剂量组，每组纳入15只，分别给予左旋多巴20mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d，通过加入25mg/kg/d的苄丝肼，现配现用。分别于上午9点和下午5点给予腹腔注射，持续注射4周。另有15只纳入对照组，给予左旋多巴以外的液体注射。

1.4 观察指标

治疗期间，对大鼠AIM行为和旋转反应时间进行观察，分别在治疗第1d、1w、2w、3w、4w对数据进行记录和评分。AIM评分可涉及前肢AIM、口面部AIM、轴性AIM和旋转AIM，不同的维度下，根据严重程度差异分为5个等级，分别用0-4表示，0代表无，1代表持续时间低于30s，2代表持续时间超过30s但是不高于60s，3代表持续时间超过60s，但是外界刺激可让其停止，4则表示持续时间在60s以上，而且，在外界的刺激下其也不能停止。每次记录时间是在用药后的20min，观察时间持续1min。

药效期计算方法为：计数用药后每5min的旋转圈数，把旋转圈数增至剂峰旋转圈数的20%的第一个5min到降至该值的第一个5min之间的时间，即旋转反应时间，记录旋转反应时间的长短。脑组织石蜡块切片，厚度为5um，按照Seaton方法进行黑质凋亡细胞检测。Bcl-2mRNA采用原位分子杂交法进行测定，标记探针为美国Santa Cruz公司产品。

2 结果

2.1 左旋多巴对运动并发症大鼠模型AIM各项评分的影响

从图1中可得，随着治疗时间的延长，大鼠模型中小剂量组、中剂量组口面AIM评分有上升趋势，大剂量组口面AIM评分有向下趋势。小剂量组前肢AIM评分有向上趋势，中剂量组和大剂量组前肢AIM评分有下降趋势。小剂量组、中剂量组轴向AIM评分有上升趋势，大剂量组轴向AIM评分有下降趋势。小剂量组、中剂量组、大剂量组旋转AIM变化趋势不明显。

图1 左旋多巴对运动并发症大鼠模型AIM各项评分的影响（左上为口面AIM结果，左下为轴向AIM结果，右上为前肢AIM结果，右下为旋转AIM结果）

在用药1d、1w、2w，三组大鼠前肢、口面、轴向AIM相比，差异不明显，在用药后，分析旋转AIM可得，小剂量组的评分显著低于另外两组，F=4.2142，3.4189，P＜0.05，差异具有统计学意义，但是中剂量组和大剂量组组间比较无统计学差异。

在用药3w、4w后，组间比较显示，前肢AIM、口面部AIM评分差别不明显，而在轴向AIM评分方面，小剂量组高于大剂量组，F=4.8821，P＜0.05，差异具有统计学意义。小剂量组和中剂量组以及中剂量组和大剂量组两两相比，差异不明显。旋转AIM分析显示，大、中剂量组评分在任一时间点的观察结果显示均显著高于小剂量组，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2.2 左旋多巴对运动并发症大鼠模型总AIM评分的影响

由图2可得，随着治疗时间的延长，大鼠模型中小剂量组、中剂量组AIM总评分有上升趋势，大剂量组AIM总评分有略微下降趋势。在用药1d和1w时，大剂量组AIM评分均高于小剂量组，P＜0.05，差异具有统计学意义。中剂量组和小剂量组组间未见明显差异。用药第2w、3w和4w时，3组大鼠总AIM评分均无明显差异。

图2 左旋多巴对运动并发症大鼠模型总AIM评分的影响

2.3 左旋多巴对运动并发症大鼠模型药效期的影响

在第1d、1w、2w、3w、4w时的旋转反应时间对比中显示，小剂量组和大剂量组在第1w、2w、3w、4w的旋转反应时间明显减少，P＜0.05，差异具有统计学意义，在中剂量组中，第2w、3w、4w的旋转反应时间均明显少于1d时的旋转反应时间，P＜0.05，差异具有统计学意义。但是，在比较用药开始到结束时的旋转反应时间发现，在减小幅度方面，小剂量组和中剂量组显著小于大剂量组，P＜0.05，差异具有统计学意义，详见下表1。

表1 左旋多巴对运动并发症大鼠模型药效期的影响

2.4 左旋多巴诱导运动并发症大鼠模型黑质细胞凋亡的结果

详见下表2，所有分组的大鼠黑质细胞凋亡数量均随着时间的推移而下降，组间比较显示，各个时间点大剂量组细胞凋亡数量显著高于中剂量组、小剂量组和对照组，经检验，P＜0.05，差异具有统计学意义。而在bcl-2mRNA表达方面（见下表3），对照组与小剂量组无明显差异，各个时间点差异不明显，中剂量组比对照组、小剂量组显著升高，大剂量组比中剂量组、小剂量组、对照组显著升高，P＜0.05，差异具有统计学意义。

表2 PD大鼠黑质细胞凋亡数量

表3 PD大鼠黑质细胞bcl-2mRNA阳性表达（%）

3 讨论

PD是一种以震颤、肌强直、运动减少、运动姿势异常为特征的慢性疾病，属于神经系统变性疾病的一种。随着人口老龄化问题的凸显，PD的发生率明显升高，严重威胁广大患者的心身健康和生活质量。在临床实践中，左旋多巴是治疗PD的金标准药物，但是，随着其应用时间的延长，患者会在2-5年出现一定的毒副反应，比如运动障碍等，这一毒副反应比疾病本身给患者带来的伤害更加严重[5-7]。

在临床试验中，PD大鼠通过长时间注射左旋多巴形成的运动并发症模型研究帕金森病运动并发症的最普遍动物模型，也是最经济可靠的模型。在试验过程中，对于大鼠模型行为学的评价，最常用的观察指标就是AIM评分和对侧旋转反应。有研究[8-12]中显示，在制备大鼠模型的过程中，关于注射剂量进行了研究，区间分布在6mg/kg/d-100mg/kg/d，研究[13]显示，与小剂量左旋多巴相比，大剂量左旋多巴的应用，可使PD大鼠的AIM评分明显增加。但是，也有研究[14]发现，大剂量左旋多巴的应用可能引发PD大鼠剧烈的旋转AIM，从而影响了AIM的评分结果。因此，在本次研究中，所选择小、中、大三种剂量，对模型大鼠进行研究，结果显示，AIM评分结果中，大剂量组和中剂量组显著高于小剂量组和对照组，3组大鼠在轴向AIM评分方面在用药初期（第1d、1w、2w）的差异不明显，在随后的观察中，大剂量组的轴向评分明显低于小剂量组（P＜0.05），可能的因素在于左旋多巴的大量应用，旋转运动剧烈，对轴向AIM造成了干扰。而随着左旋多巴应用剂量的上升，口面AIM和前肢AIM的评分并没有增加，轴向AIM的评分反而被削弱，推测也与剧烈旋转AIM干扰有关。

对旋转反应时间的统计发现，在剂量不同的组别内，PD大鼠的旋转反应时间也存在明显不同，但是，在旋转反应时间缩短程度的比较中，大剂量组的大鼠要更加显著区别于中剂量组和小剂量组，而且，而且，通过大剂量的注射后，给PD大鼠造成的持续时间得到延长，旋转反应表现也更加稳定。有学者在实验后指出，由于谷氨酸受体拮抗剂的作用，导致了下丘脑核损伤，以及儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂的使用，PD大鼠的旋转反应时间得到明显缩短，效果显著，可见，其对PD患者的疗效减退这一问题具有良好的预防作用。这也充分佐证了PD大鼠在注左旋多巴后所体现出来的旋转反应时间缩短具有着同样的药理作用，与PD患者的疗效减退别无二致，由此可得，其可以作为重要的疗效评价指标[15-16]。本课题的研究结果指出，出于不同剂量的对比，大剂量的注射左旋多巴表现出的旋转反应时间缩短更为稳定。这一指标也显示出了大鼠黑质DA能神经元的受损程度。随着用药剂量的增加，大鼠体内存留的药物量也就越大，所带来的神经毒性也更加严重，从而对黑质细胞造成了更加严重的损伤，在小剂量组内，细胞凋亡幅度最小，这充分证明小剂量左旋多巴可以达到治疗PD的效果，从而也保证了神经毒性的最小化。进一步开展左旋多巴神经毒性作用的分子生物学机制，结果发现，不同剂量左旋多巴对细胞凋亡抑制基因bcl-2mRNA的表达产生了重要影响，随着治疗时间、用药剂量的增加，bcl-2mRNA阳性表达率增加，表达部位在黑质细胞浆。也有学者发现，bcl-2mRNA能够对大鼠黑质细胞产生保护作用，避免其产生氧化应激损伤。而bcl-2mRNA的过度表达，能够组织细胞凋亡，特别是由自由基损伤造成的神经细胞凋亡。

因此，在临床实践中，应用左旋多巴对PD患者治疗时，应该从最小剂量开始，并逐步寻找最佳的剂量范围，减少患者的神经毒性作用。bcl-2mRNA为左旋多巴诱发黑质细胞凋亡的调控基因，当产生神经毒性后，可以尝试延长服药间隔时间或者停药一段时间。