外周血单个核细胞中NF-κBmRNA表达和血清IL-6水平与TKA术后DVT的关系

严志强 解绪红 冯凌思 刘永轶

【摘要】 目的：探討外周血单个核细胞（PBMC）中核因子-κB（NF-κB）mRNA表达和血清白介素-6（IL-6）水平与膝关节置换术（TKA）术后下肢深静脉血栓形成（DVT）的关系。方法：选择2017年4月-2021年3月在广东省佛山市高明区人民医院行TKA的123例患者作为研究对象，术后根据彩超诊断结果判断是否有血栓形成，分为血栓组和正常组，比较两组一般资料和PBMC中NF-κB mRNA相对表达量、血清IL-6水平差异。根据DVT严重程度将血栓组分为轻度组、中度组和重度组，比较三组上述各指标差异，分析上述指标和DVT严重程度的相关性。采用多因素logistic回归分析TKA术后DVT危险因素。结果：TKA术后预防性用药后21例（17.07%）患者出现DVT，血栓组BMI≥28 kg/m2、术前诊断类风湿性关节炎（RA）患者的比例均显著高于正常组（P<0.05）。血栓组PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均显著高于正常组，且随着DVT严重程度增加而升高，Spearman相关分析显示两者与DVT严重程度均呈正相关（P<0.05）。多因素logistic回归分析结果显示，BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均是TKA术后DVT的独立危险因素（P<0.05）。结论：PBMC中NF-κB mRNA高表达和血清IL-6水平升高均与TKA术后DVT有关。对于肥胖、术前诊断RA患者行TKA且术后PBMC中NF-κB mRNA高表达和血清IL-6水平明显升高者应提早做好预防措施，降低DVT发生的风险。

【关键词】 膝关节置换术 下肢深静脉血栓形成 核因子-κB 白介素-6

[Abstract] Objective： To study the relationship between nuclear factor-κB （NF-κB） mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and serum interleukin-6 （IL-6） level and deep vein thrombosis （DVT） of lower limbs after knee replacement （TKA）. Method： A total of 123 patients who underwent TKA in Foshan Gaoming District People Hospital from April 2017 to March 2021 were selected as the research objects. After operation， they were divided into thrombus group and normal group according to the results of color Doppler ultrasound diagnosis. The general data， the relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and the serum IL-6 level of two groups were compared. According to the severity of DVT， they were divided into mild group， moderate group and severe group. The differences of the above indicators among three groups were compared and the correlation between the above indicators and the severity of DVT was analyzed. Multivariate logistic regression was used to analyze the risk factors of DVT after TKA. Result： DVT occurred in 21 cases （17.07%） after preventive medication after TKA. The BMI≥28 kg/m2 and the proportion of patients diagnosed with rheumatoid arthritis （RA） before operation in thrombus group were significantly higher than those in normal group （P<0.05）. The relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and the serum IL-6 level in thrombus group were significantly higher than those in normal group， and increased with the increase of DVT severity. Spearman correlation analysis showed that both of them were positively correlated with DVT severity （P<0.05）. The multivariate logistic regression analysis showed that BMI， RA， the relative expression of NF-κB mRNA in PBMC and serum IL-6 level were independent risk factors of DVT after TKA （P<0.05）. Conclusion： The high expression of NF-κB mRNA in PBMC and the increase of serum IL-6 level are related to DVT after TKA. For obesity， those patients with RA diagnosed by TKA before operation， those NF-κB mRNA expression in PBMC and serum IL-6 level increased significantly after operation， should take preventive measures in advance to reduce the risk of DVT.

[Key words] Total knee arthroplasty Deep venous thrombosis of lower limbs Nuclear factor-κB Interleukin-6

First-authors address： Foshan Gaoming District Peoples Hospital， Foshan 528500， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.18.001

全膝关节置换术（TKA）对多种膝关节疾病终末期的治疗效果显著。随着我国老龄化加剧，手术量逐年递增，其相关并发症发生率亦逐年增加，其中下肢深静脉血栓形成（DVT）是术后常见并发症之一，也是导致肺栓塞（PE）甚至死亡的主要原因[1]。目前，较多学者对TKA术后并发DVT的危险因素和发病机制进行研究，但尚未形成统一定论[2]。早期对DVT进行监测、评估并及时处理非常重要。有研究表明，外周血炎症细胞因子水平及其上游基因参与DVT形成[3-6]。核因子-κB（NF-κB）是控制DNA转录、调节炎症反应及免疫应答的核心转录因子，可启动多种炎症基因的表达，其可能促进血小板活化、聚集等过程，参与DVT形成[7-8]。本研究通过检测TKA术后DVT患者外周血单个核细胞（PBMC）中NF-κB mRNA相对表达量和血清白介素-6（IL-6）水平，以观察两者与TKA术后DVT形成的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年4月-2021年3月在广东省佛山市高明区人民医院行TKA的123例患者的临床资料。纳入标准：年龄60～80岁;具有全膝关节置换术适应证，无明显手术禁忌证;彩超诊断DVT标准以及DVT严重程度评定标准，可参照张永刚等[9]和何菊梅等[10]方法，术后进行分组;患者知情同意，依从性好，能全程配合彩超检查及抽血检测。排除标准：合并心、肝、肾等重要脏器损伤;合并充血性心力衰竭、静脉曲张、囊性纤维化、败血症、全身感染、癌症、炎症性肠病和狼疮等疾病;长期吃激素、抗凝药、非固醇类药物;近3个月内进行关节翻修手术或血管手术。术后根据彩超诊断结果判断是否有血栓形成将患者分为血栓组（n=21）和正常组（n=102）。本研究通过本院伦理委员会批准（批准编号：2018117），患者和家属已知情同意并同意签署告知书。

1.2 方法 所有患者术前及术后1、3 d，采集空腹静脉血3 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min离心10 min，取上层血清冻存于-80 ℃备用。通过ELASA法检测血清中IL-6浓度。另外相同时间相同方法采集3 mL置入EDTA抗凝管，采用Ficoll密度梯度离心法提取外周血PBMC，分离出PBMC后置冰箱保存待用。采用RT-qPCR检测PBMC中NF-κB mRNA表达量。具体方法如下：无菌条件下抽提PBMC总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。引物序列：NF-κB，Forward：5-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3，Reverse：5-GGGGTTGTTTGTTGGTCTGGA-3;β-actin，Forward：5-GTGACGTGGACATCCGCAAAG-3，Reverse：5-GGAAGGTGGACAGCGAGGC-3。RT-qPCR反应体系20 μL，包括cDNA 0.5μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Nuclear-free水補足至20 μL。在荧光定量PCR仪上（美国ABI公司）进行扩增，设置条件参数：95 ℃预变性1 min、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、60 ℃延伸30 s、40个循环重复。复3孔，计算平均Ct值。相对表达量采用2-ΔΔCt方法，即血栓组ΔCt=血栓组[目的基因Ct值-内参Ct值];正常组ΔCt=正常组[目的基因Ct值-内参Ct值];ΔΔCt=血栓组ΔCt-正常组ΔCt。

1.3 观察指标 比较两组性别、年龄、体重指数（BMI）、是否合并高血压、是否合并糖尿病、术前是否诊断为RA。比较两组PBMC中NF-κB mRNA相对表达量（最后用于统计的数据为术前和术后1、3 d三次数值取平均数）和血清IL-6浓度（数据处理同NF-κB mRNA相对表达量）差异，比较血栓轻度组、中度组和重度组三组上述各指标差异，分析上述指标与DVT严重程度的相关性。采用多因素logistic回归分析TKA术后DVT的危险因素。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行数据统计。正态分布的计量资料采用（x±s）表示，两组比较采用独立样本t检验，三组比较采用随机区组设计的方差分析，并采用SNK法进行组间两两比较。计数资料以率（%）表示，两组比较采用字2检验。采用Spearman进行相关性分析，采用多因素logistic回归分析TKA术后DVT危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 纳入的123例患者，男66例，女57例;年龄60～80岁，平均（71.34±7.66）岁。TKA术后预防性用药后，共21例（17.07%）患者出现DVT，其中，轻度血栓12例，中度血栓5例，重度血栓4例。两组性别、年龄、高血压、糖尿病比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;血栓组BMI≥28 kg/m2、RA的比例均高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组各观察指标比较 血栓组PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均显著高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 不同程度血栓组各观察指标比较 两个指标均随着DVT严重程度增加而升高，即重度组>中度组>轻度组，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4 各观察指标与DVT严重程度的相关性分析 采用Spearman相关分析显示，PBMC中NF-κB mRNA相对表达量、血清IL-6水平与DVT严重程度均呈正相关（rs=0.421、0.621，P=0.000）。

2.5 危险因素分析 以BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平作为自变量，赋值BMI<28 kg/m2为0，BMI≥28 kg/m2为1，赋值术前诊断非RA为0，术前诊断RA为1，PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均为原始数据，以TKA术后是否发生DVT作为因变量，进行多因素logistic回归分析，结果显示BMI、RA、NF-κB和IL-6均是TKA术后发生DVT的独立危险因素，见表4。

3 讨论

DVT是指在人体深静脉中形成血凝块，导致深静脉回流受阻，是静脉血栓栓塞性疾病之一，最常出现部位为腿部或骨盆的大静脉，表现为单侧腿部疼痛、发红和肿胀，严重者与PE和血栓形成后综合征（PTS）密切相关，两者被认为是TKA术后导致死亡和增加医疗费用的主要原因[11-13]。目前DVT的发病机制尚未统一定论。有学者提出三联起因，即静脉淤滞、血液高凝性和血管壁损伤[4]。随着研究的深入，越来越多的证据表明炎症反应可能导致DVT[2，14-15]。文献[16-18]报道许多危险因素可能导致DVT，如手术、肥胖、癌症、RA、炎症性肠病等可能通过炎症介质调节血栓形成。不同于其他血栓形成的创伤机制，包括血管横断和随后暴露于内皮下胶原蛋白和其他促凝细胞外基质材料，血管壁的炎症可能引发完整静脉血栓形成，激活内皮细胞、血小板和白细胞，随后形成微粒，可通过诱导组织因子来触发凝血系统[2，4]。研究表明TKA术后采取预防性用药的前提下DVT的发生率低于30%[4]。本研究结果显示，TKA术后预防性用药DVT发生率为17.07%，血栓组肥胖（BMI≥28 kg/m2）、术前诊断为RA的比例均高于正常组（P<0.05），符合上述研究结论，可能原因在于肥胖会导致凝血系统加强和纤溶活性下降，RA患者全身炎症反应，均可通过炎症反应导致DVT。

研究证实，血栓发生与NF-κB信号通路的激活密切相关[3，7]。NF-κB是炎症和免疫稳态的主要调节因子，通过转录控制大量重要的促炎因子和抗炎因子来达到这一稳态。在促炎反面，NF-κB可诱导许多促炎因子（如IL-6等）和趋化因子等炎性靶基因的过度持续表达，驱化大量炎性细胞浸润，最终造成炎症反应，反过来，这些细胞因子又进一步活化NF-κB，造成持续放大的炎症反应[8，19]。Cheng等[20]研究显示DVT大鼠血栓和炎症反应加重可能与TLR-4/NF-κB炎症信号通路的激活有关;叶柳青等[21]发现孕鼠DVT血管内皮细胞中NF-κB明显激活。IL-6由多种免疫细胞产生，被称为“前炎症细胞因子”，在全身应激反应、免疫调节、炎症反应中具有重要作用，可活化中性粒细胞，刺激肝脏合成急性反应期血浆蛋白，是急性炎症反应最主要的细胞因子[22]。研究报道IL-6表达升高与DVT的形成有关[4];DVT患者血清IL-6水平显著升高，经药物干预后明显下降[23]。Du等[24]研究发现腹部恶性肿瘤术后DVT患者IL-6、NF-κB水平显著高于无DVT者。本研究结果显示，血栓组PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均显著高于正常组（P<0.05），且兩个指标均随着DVT严重程度增加而升高，表明TKA术后DVT患者PBMC中NF-κB mRNA高表达和血清IL-6水平升高与血栓形成相关，提示两者可作为评估TKA术后DVT严重程度的指标。

张永刚等[9]研究发现全髋关节置换术后DVT患者血清细胞因子水平显著高于正常组，且与DVT严重程度呈正相关。本研究Spearman相关分析结果显示，PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平与TKA术后DVT严重程度均呈正相关，表明随着NF-κB表达和IL-6水平升高，血栓严重程度逐渐升高。可以根据NF-κB表达和IL-6水平高低对DVT严重程度进行初步评估。笔者进一步采用多因素logistic回归分析TKA术后DVT的危险因素，结果显示BMI、RA、PBMC中NF-κB mRNA相对表达量和血清IL-6水平均是TKA术后发生DVT的独立危险因素。因此，笔者认为，对于肥胖、术前诊断RA患者行TKA且术后PBMC中NF-κB mRNA高表达和血清IL-6水平明显升高者应提前做好预防措施，以降低DVT发生的风险。

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（收稿日期：2021-05-06） （本文编辑：程旭然）