从活血通络法探讨川芎嗪抗肝纤维化的作用机制研究进展

潘富珍 刘 定

黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江哈尔滨 150040

肝纤维化是由于各种致病因子长期刺激，如酒精中毒、代谢异常、病毒、自身免疫反应、胆汁淤积等。在肝损伤过程中，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活，产生过量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），其生成大于降解。如果持续肝损伤就会发展成纤维化，甚至肝硬化和肝癌。肝纤维化的中心环节是HSCs 活化[1]。

近年来发现中药中提取的一些单体具有延缓肝纤维化进展，甚至逆转，有独特的优势[1]。川芎是活血类药物，入肝经，有活血化瘀、行气之功效。川芎嗪是川芎根茎提取的有效成分，为吡嗪类生物碱。可显著改善患者肝功能，同时降低肝纤维化中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，透明质酸和层粘连蛋白，降低肝组织中丙二醛含量，还具有抑制成纤维细胞分裂、增殖的作用，从而达到防治肝纤维化的目的[2]。本文对近年川芎嗪治疗肝纤维化机制研究进展综述如下：

1 活血通络理论在肝纤维化治疗中的临床应用

肝纤维化基本病机属于正虚血瘀，正虚为肝、脾、肾亏虚，血瘀证贯穿肝纤维化始终，且肝纤维化与血瘀程度密切相关，应用活血化瘀通络之法，以改善机体肝内气滞血瘀的状态[3]。若各种病因导致肝失疏泄，日久可引起肝血瘀滞，而瘀血内阻，蕴结于肝，必然损其肝体，阻其肝用，加重肝血瘀滞，形成肝纤维化过程中的病理基础。《医学发明·五邪相干》中记载：“血者，皆肝之所主，恶血必归于肝。”揭示了瘀血与肝的重要关系。川芎入肝经，属于血中之气药，能上行头目，下调经水，中开郁结，旁通脉络，活血行气，发挥活血通络功效。川芎嗪具有活血化瘀、抗血小板凝聚、直接清除具有细胞毒性作用的自由基、扩张小动脉、保护内皮细胞、改善微循环、抗脂质过氧化及拮抗脏器纤维化等作用[2]。

2 川芎嗪抗肝纤维化作用机制

2.1 参与诱导活化HSCs 凋亡

HSCs 已成为维持正常肝脏稳态和生长的主要调节因子，也是导致肝纤维化的中心环节。诱导活化的HSCs 发生凋亡有助于肝纤维化逆转。川芎嗪能够抑制HSCs 增殖，通过抑制ERK 通路并活化p53 蛋白表达，增强p21 和p27 蛋白效应。降低Fas/FasL 细胞因子的表达，阻断肝细胞凋亡，引起HSCs 发生线粒体凋亡。HSCs 细胞周期停滞于G0/G1期，还可以降低线粒体膜电位，上调Bax，下调Bcl-2 表达，促进释放Cytc，最终由凋亡蛋白酶caspases 执行促进HSCs 细胞凋亡[4]。

2.2 参与抑制细胞因子

ECM 由基底膜样基质向间质基质转变，这些基质蛋白共同激活原本处于静息状态的HSCs，导致ECM过度分泌，进一步激活HSCs，形成正反馈环。HSCs 活化相关细胞因子如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、结缔组织生长因子（con nective tissue growth factor，CTGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。下调这些因子能够有效抑制HSCs 活化，阻止过度合成ECM，发生抗肝纤维化作用。

2.2.1 TGF-β1 TGF-β 细胞因子有30 多种，肝纤维化与TGF-β1 最相关。Smad 蛋白家族是其下游介质。肝脏长期受损时，TGF-β1 与其受体TGFβ-R 结合，导致Smad2 和Smad3 磷酸化，须与Smad4 结合转位到细胞核，调控特定基因表达，激活信号通路，ECM 合成过多，引起肝纤维化。而胞浆中Smad6、Smad7 具有负性调控作用，拮抗TGF-β1 所介导的肝纤维化[5]。川芎嗪通过阻断TGF-β1 细胞因子下游介导通路，抑制Smad2/3 的表达，提高Smad7 的水平，从而阻止肝纤维化的进展[6]。研究发现[7]，试验组用川芎嗪联合γ干扰素治疗乙肝型肝纤维化，肝纤维化标志物、TGF-β1、Smad2/3/4 下降明显优于对照组（单独使用γ 干扰素）。

2.2.2 PDGF PDGF 属于血清衍生成分的一种，促进HSCs发生高效有丝分裂，有PDGF A、B、C、D 四个基因产物，构成4 个同源二聚体和1 个PDGF-AB 异源二聚体。这些生长因子通过与其功能受体PDGFRα/α、β/β、α/β 结合，激活受体蛋白酪氨酸激酶中两个基因编码PDGFRA 和PDGFRB 来调节其作用，是对HSCs 有潜在趋化作用的细胞因子。当肝细胞发生损害时，过度释放PDGF，作用于HSCs 膜上相应受体，激活特异性信号因子而参与免疫应答[8]。川芎嗪阻止过氧化氢活化的HSCs 增殖。其机制是川芎嗪降低大鼠PDGFβR 表达量，PDGF-βR 下游的ERK 磷酸化和p38 通路作用受到阻断。可能与川芎嗪降低肝纤维化标志物基因表达，以及调控参与HSCs 活化和ECM 内稳态调节至关重要的蛋白有关[9]。

2.2.3 CTGF CTGF 能够调控细胞增殖、分化、黏附、血管生成以及组织纤维化。其作为TGF-β 下游介质，诱导细胞周期从G1晚期进入S 期。激活细胞发生有丝分裂，增加成纤维细胞增殖及强烈趋化作用。引起细胞发生增殖并沉积，促进释放过度ECM 及积聚，同时还能有效防止ECM 降解[10]。研究发现[11]，川芎嗪可能通过下调CTGF，阻断合成Ⅰ型胶原，发挥抗肝纤维化。川芎嗪抑制HSCs 增殖而改变其周期。此外还可降低HSCs-T6 细胞Bcl-2、CTGF 的表达，增加Bax，从而有效抗纤维化。通过降低CTGF 和Smad2/3 的表达，呈剂量和时间依赖性抑制TGF-β1 诱导的HSCs-T6 细胞的增殖，拮抗肝纤维化[12]。

2.2.4 VEGF VEGF 属于多功能蛋白中一种，与其受体VEGF-R1 和VEGF-R2 相结合。属于目前最强烈的促血管生成调控因子，刺激血管内皮细胞增殖、迁移和调节血管渗透性，以及内皮细胞生长、迁移[13]。肝纤维化与形成肝内新生血管息息相关，VEGF 是重要的促血管形成的生长因子，推动肝纤维化。川芎嗪对肝脏的保护作用提供了新的视角，通过下调VEGF-A、VEGF-R2、PDGF-BB 和PDGF-βR 等4 种重要促血管生成因子，抑制血管生成[14]。

2.3 参与调控脂肪细胞因子

脂肪细胞因子来源于脂肪组织，在肝脏中传递动态功能，参与调控机体稳态，并参与调节肝纤维化或阻止肝纤维化。血浆中最丰富的脂肪因子脂联素，除了在脂质和糖代谢方面存在作用外，还具有抗炎反应和肝保护作用，通过多种机制阻止肝纤维化发展。脂联素与其受体结合后产生信号，对各种肝病起保护作用。瘦素由脂肪组织产生，影响肝内胰岛素信号通路，增加肝细胞内脂肪酸含量，最终引起肝细胞变性，促进HSCs 分化，促进肝纤维化发生[15]。

2.3.1 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制剂 肝组织内ECM 降解由MMPs 介导，相应金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）则妨碍其活性。纤维化的程度取决于MMPs 与TIMPs 间的平衡。改变MMP-1 与TIMP-1 比值，抑制TIMP-1 表达，阻止HSCs 增殖和迁移，可预防肝纤维化发生[15]。研究发现[16]，川芎嗪减少胶原和透明质酸，通过增加MMP-13 表达，作用于HSCs，有效调节ECM 发生降解，由于上调MMP-13/TIMP-1 比例，发挥逆转肝纤维化作用。

2.3.2 瘦素 瘦素是促进HSCs 活化的因子，HSCs 被激活后反过来产生更多瘦素，此正反恶性循环，使TGFβ1 也随之增加，引起肝纤维化。主要是JAK/STAT 通路被激活，导致下游转录因子STAT3 活化后，促进形成ECM，进而诱发肝纤维化[17]。盐酸川芎嗪中有效成分川芎嗪能够降低血清中TIMP-1 及瘦素水平，阻断HSCs 活化，发挥抗纤维化的作用[18]。研究显示[19]，川芎嗪抑制瘦素诱导的JAK1/STAT3 信号通路的激活，导致α-SMA 和Ⅰ型胶原的减少，从而阻碍HSCs 活化，拮抗肝纤维化。

2.4 参与调控炎症因子

炎症反应属于纤维化的始发阶段，肝细胞受损时，引发炎症反应，诱导HSCs 活化。白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）属于抗炎因子中一种，抗肝纤维化。IL-1 促进HSCs 活化，并导致生成MMP-13、TIMP-1 和MMP-9，发生肝纤维化。IL-17 也可激活HSCs，产生Ⅰ型胶原蛋白，还可以刺激库普弗（Kupffer cells，KCs）细胞表达，促进释放IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎症因子，导致肝纤维化[20]。研究显示[21]，川芎嗪对于刀豆蛋白A 诱导的肝纤维化小鼠起到抑制作用，其机制是下调IL-6、IL-1β、TNF-α，上调IL-10。川芎嗪减轻肝纤维化，通过降低TNF-α、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和IL-1β 水平，抑制炎症反应，保护肝脏免受四氯化碳所致纤维化[22]。

2.5 参与调节氧化应激反应

氧化应激是指有氧代谢产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS）与抗氧化系统清除能力之间的平衡失调。ROS/RNS 激活转录因子NF-κB 信号，提高IL-6、IL-1β 促炎因子表达；炎症细胞活化后，反过来又促进ROS/RNS 产生，加剧氧化应激水平。ROS 也可激活核因子相关因子2（nuclear factor related factor 2，Nrf2）、TGFβ、NF-κB 等相关信号分子及其下游信号通路，调控肝纤维化。肝损伤后，HSCs 被细胞因子和KCs 释放的ROS 激活，导致HSCs 增殖、合成和分泌ECM[23]。研究显示[24]，川芎嗪显著增强HSCs 中Nrf2 的表达和核移位，其抗肝纤维化机制是阻断Nrf2/β-catenin 通路，对HSCs 行为的负调控。川芎嗪联合丹皮酚在体内外均有明显抗肝纤维化作用。这可能是由于HSCs 线粒体功能破坏，从而诱导氧化应激、凋亡、炎症和抑制ECM 形成与沉积[25]。

2.6 调节肝窦内皮细胞

肝窦内皮细胞（hepatic sinusoidal endothelial cells，LSEC）位于肝脏Disse 间隙内，其特异结构是具有筛选屏障的窗孔和基底膜。肝纤维化出现肝窦毛细血管化，失窗孔、连续基底膜以及HSCs 活化。HSCs 活化和肝纤维化中LSEC 发挥关键作用，正常分化的LSEC能够使活化的HSCs 逆转至静息状态，抑制肝纤维化进展。肝损伤时，LSEC 成为促炎症因子，同时分泌一系列细胞和趋化因子，加速肝脏炎症反应以及免疫功能发生改变[26]。研究发现[27]，川芎嗪能抑制典型Hedgehog，抑制体外培养HSCs 血管生成，改善小鼠肝纤维化和肝窦血管生成；还改善HIF-1α，抑制Hedgehog信号传导，阻止肝窦性血管生成。此外，川芎嗪抑制四氯化碳诱导肝纤维化模型中LSEC 毛细血管化[28]。

2.7 自噬与肝纤维化

自噬对于肝纤维化具有双重作用，一方面肝纤维化发生通过HSCs 活化，是由于氧化应激介导的内质网应激；通过自噬降解脂滴供应HSCs 活化所需的能量以及自我更新。另一方面抗纤维化作用，肝细胞自噬不仅降低肝细胞死亡，而且通过调控巨噬细胞抑制炎症因子释放[29]。动物研究显示[30]，川芎嗪最佳浓度为25 ng/mL 时能够刺激大鼠HSCs-T6 的自噬溶酶体，加速自噬溶酶体降解，削弱自噬，阻止肝纤维化持续进展。川芎嗪能明显减轻肝纤维化，调控免疫系统的不平衡，降低ECM 积聚以及肝纤维化中的自噬信号，抑制AKT-mTOR 信号通路[22]。

3 问题与展望

综上所述，肝纤维化形成具有复杂的病因及发病机制。包含多种细胞因子、炎症以及氧化应激反应，构成复杂的调控网络。其病理基础是瘀血阻络，基本病机属于气滞血瘀，瘀血阻络。基本治疗方法为活血通络。中药川芎为血中之气药，气血同治，气行则血行，为肝纤维化活血化瘀的常用药物。川芎嗪为川芎中主要有效成分。综合近年研究，发现川芎嗪能通过调控TGF-β1、PDGF、VEGF 和CTGF 多种细胞因子，抑制HSCs 活化；诱导活化的HSCs 凋亡；调控脂肪细胞因子、肝脏炎症反应；抗氧化应激、调节肝窦内皮细胞、自噬等发挥抗肝纤维化作用，减缓肝纤维化进一步发展，甚至能够有效逆转已经发生的肝纤维化。但是，目前针对川芎嗪抗肝纤维化研究多局限于单一信号通路或肝纤维化相关因子影响方面，对细胞自噬、外泌体、免疫调节方面研究较少。基于自噬与免疫调节在肝纤维化中的重要作用，将进一步研究中医药在免疫调节方面作用，为阐明中医药抗肝纤维化作用机制提供更多实验依据。