RPE细胞发生上皮间充质转化机制及PVR的治疗研究进展

崔海悦，陆 宏

0引言

视网膜脱离修复术后，增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)引起术后视网膜脱离的发生率为5%～10%[1]。目前手术是治疗PVR的主要方法，但是术后仍有一定的复发风险，所以术后有必要进行药物辅助治疗，预防PVR的发生[2]。研究表明PVR主要病理过程是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，使RPE细胞转化为成纤维细胞，细胞迁移能力、侵袭性、抗凋亡能力增强以及细胞外基质重构失调，最终导致PVR的发生[3]。玻璃体腔存在各种细胞因子，在细胞因子诱导下细胞迁移进入玻璃体腔，这些因子还可以促进细胞外基质的产生[4]。因此从RPE细胞和细胞因子入手寻找安全有效的治疗方法具有重要的临床意义。

1相关信号通路

PVR的主要病理过程为RPE细胞发生EMT[5]，RPE细胞迁移到视网膜前表面增殖形成具有收缩性的纤维膜。上皮细胞转化为具有迁移能力的间质细胞在发育和伤口愈合的过程中起重要作用，在病理上促进纤维化[6]。以下通路介导了RPE细胞增殖、迁移和EMT过程，在PVR的发生机制中起关键作用。

1.1Notch通路Notch信号通路是一种进化保守的信号通路，参与许多生理和病理过程，包括胚胎发育[7]、癌症转移[8]和纤维化疾病[9]。研究发现阻断Notch信号通路可以抑制RPE细胞增殖和迁移[10]。Zhang等[11]通过体内外实验研究证明γ-分泌酶抑制剂和特异性Notch信号通路抑制剂在体外实验中抑制RPE细胞EMT过程，在小鼠体内实验中抑制了PVR的进展。玻璃体内注射γ-分泌酶抑制剂可以抑制RPE细胞诱导的PVR形成，抑制M2型巨噬细胞浸润。Notch信号通路可能通过调节M2型巨噬细胞极化来调控PVR的形成[12]。

1.2PI3K/AKT通路磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶通路(AKT pathways)和雷帕霉素的哺乳动物靶点mTOR信号通路在细胞生长和生存等方面至关重要。PI3K/AKT通路介导细胞转化、迁移、增殖、凋亡等，mTOR是多种有丝分裂信号通路的关键中介，在调节正常细胞增殖中起核心作用[13]。Cai等[14]研究发现，PVR患者视网膜中PI3K/AKT/mTOR细胞信号通路被激活，应用该通路特异性抑制剂雷帕霉素和LY294002之后RPE细胞增殖受到抑制。白花丹素也可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制RPE细胞增殖，阻止PVR的进展[15]。有研究证明上调糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的表达，可以通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制RPE细胞EMT过程[16]，应用GSK-3β抑制剂或敲降GSK-3β基因可促进TGF-β1诱导的ARPE-19细胞EMT过程，过表达GSK-3β和应用PI3K/AKT抑制剂可以抑制ARPE-19细胞EMT过程[17]。

1.3p38-MAPK通路丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases, p38-MAPK)是一类进化保守的丝氨酸/苏氨酸丝裂原活化蛋白激酶，p38-MAPK参与调节多种细胞内反应，在炎症、细胞周期调节、细胞死亡、发育、分化、衰老和肿瘤发生等方面发挥作用[18]。Schiff等[19]实验结果发现患者PVR膜的全转录组RNA测序显示P38-MAPK信号通路激活。抑制p38能够抑制TGF-β和TNF-α共同诱导的成年人RPE(adult human RPE，ahRPE)细胞转化和细胞膜收缩，并且p38被抑制后TGF-β和TNF-α共同诱导的膜收缩性可以被逆转。有研究发现当RPE细胞被玻璃体或增生性膜拉伸会产生机械压力，该机械压力可以通过激活p38通路上调基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase 2, MMP2)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)的表达。MMP2的高表达促进了RPE细胞周围细胞基质重塑，减弱RPE细胞间的粘附，促进了RPE细胞的迁移[20]。上述研究对靶向p38-MAPK通路治疗PVR提供了理论基础。

1.4TGF-β/Smad通路转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)在纤维化疾病中起关键作用，Smad蛋白是TGF-β的细胞内关键的效应因子[21]。Yao等[22]研究发现骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)能够通过抑制Smad2/3磷酸化来抑制TGF-β诱导RPE细胞发生EMT。Smad7抑制了ARPE-19细胞中TGF-β2/Smad信号通路以及I型胶原的表达。在体内，Smad7过表达导致Smad2/3信号抑制，从而抑制RPE细胞发生纤维化转变[23]。

1.5Rho/ROCK通路ROCK是一种Rho相关蛋白激酶(rho-associated protein kinase),研究发现Rho/ROCK信号通路在细胞收缩、迁移、凋亡、存活和增殖等过程中具有多种功能[24]。研究发现选择强效的ROCK抑制剂舒法地尔几乎完全阻断了玻璃体诱导的ROCK下游靶点肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化和胶原凝胶收缩。在体内实验中，舒法地尔明显抑制了兔实验性PVR的进展[25]。TGF-β和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)通过激活RhoA/ROCK信号通路上调细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组分的表达，包括FN、层粘连蛋白(laminin，LN)、MMP2和I型胶原。在此过程中，ARPE-19细胞从上皮细胞转变为间质细胞。RhoA/ROCK通路也许是预防RPE细胞纤维化的潜在靶点[26]。ROCK和RhoA抑制剂可能成为治疗PVR的新靶向药物。

1.6Wnt/β-catenin通路典型的Wnt/β-钙黏着蛋白(β-catenin)信号通路是一个复杂的、进化保守的信号机制，调节关键的细胞功能，包括增殖，分化，迁移，凋亡和干细胞更新[27]。研究证明β-catenin信号通路特异性抑制剂在体外能够阻止RPE细胞纤维化和收缩膜的形成，玻璃体腔内注射能够抑制视网膜表面致密收缩膜的形成。β-catenin信号通路参与了由去分化的RPE细胞形成的收缩膜[28]，Zhang等[16]研究证实上调GSK3β可以通过抑制Wnt/β-catenin通路有效抑制EMT。提示以该通路为靶点的辅助治疗可能有助于预防PVR的发生。

1.7JAK/STAT通路苏氨酸激酶(janus kinase，JAK)/STAT信号通路(signal transducer and activator of transcription pathways，STAT)是生长因子和细胞因子信号通路的重要组成部分，也是许多免疫、炎症和造血疾病的重要靶点。研究发现白介素-6(interleukin 6, IL-6)在体内外均能诱导RPE细胞增殖和EMT，阻断IL-6/JAK1/STAT3通路可以抑制RPE细胞增殖和EMT过程进而阻止PVR进展[29]。白介素-2(interleukin 2, IL-2)能够促进PRE细胞发生EMT，JAK/STAT3和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路被激活。应用JAK/STAT3和NF-κB信号通路特异性抑制剂能明显抑制IL-2诱导的RPE细胞迁移、ECM合成[30]。以上研究结果证明抑制炎症或阻断JAK/STAT3通路可能是预防和治疗PVR的有效方法。

2治疗

PVR膜的形成源于血视网膜屏障的破坏， RPE细胞、成纤维细胞、胶质细胞和巨噬细胞等细胞向视网膜下间隙及玻璃体腔迁移和增殖，形成具有收缩性的纤维增殖膜，研究发现RPE细胞在PVR形成中占据主导地位[31-32]。因此，有大量研究从RPE细胞入手，寻找药物治疗PVR的方法。

2.1天然物质提取物研究发现一些天然物质对RPE细胞的增殖迁移具有抑制作用，且毒性作用小。很多天然物质提取物具有抗炎、抗氧化、抗增殖、抗肿瘤等作用。例如，姜黄素是姜科植物根茎中的一种天然成分，具有高安全性、低毒性、治疗用途广和成本低等优点。研究证明姜黄素能通过P53通路诱导细胞周期阻滞在G2期；还可以抑制AKT、MAPK信号通路，抑制RPE细胞的增殖和EMT过程[33]。二氢杨梅素(dihydromyricetin， DHM)是蛇藤中的黄烷醇化合物，DHM可以通过降低MMP2的表达，减弱RPE细胞的侵袭和迁移[34]。白藜芦醇(resveratrol，Res)一种天然的多酚类的化合物，Res可通过血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptorβ，PDGFRβ)、PI3K/AKT和MAPK通路有效抑制PDGF-BB诱导的RPE细胞迁移[35]。非瑟酮(fisetin)是一种黄酮醇，从多种水果和蔬菜中分离出来，可以通过调节AKT/转录因子特化蛋白-1(transcription specificity protein 1，Sp1)依赖性的MMP-9转录活性，抑制表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)诱导的RPE细胞迁移[36]。槲皮素是从余甘子等植物中提取的一种天然多酚类黄酮化合物，研究结果证明槲皮素能够抑制TGF-β诱导的RPE细胞增殖、迁移和EMT过程，还可以通过Smad2/3途径逆转RPE细胞EMT过程[37]。白花丹素(plumbagin，PLB)是从白花楸根中提取的物质，Chen等[38]通过建立兔PVR模型研究发现，白花丹素在体外能够抑制兔RPE细胞迁移，侵袭和EMT过程，在兔PVR模型中给予PLB治疗组的PVR级别低于未治疗组。PLB能够使ARPE-19细胞周期阻滞于G2/M期，并且通过调控B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2， Bcl-2)家族相关基因表达来促进ARPE-19细胞凋亡；PLB通过抑制PI3K和p38 MAPK信号通路抑制ARPE-19细胞增殖[15]。藏红花素(crocetin)属于类胡萝卜素家族，是藏红花的主要成分。藏红花素可以抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡，抑制缺血再灌注引起的视网膜损伤，抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)诱导的新生血管的生成。研究发现藏红花素(50～200μM)以浓度依赖性和时间依赖性抑制ARPE-19细胞的迁移，并通过诱导细胞发生G1期阻滞，降低增殖细胞核抗原(proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)蛋白表达，增加p21和p53基因的积累抑制细胞增殖[39-40]。动物体内实验证明玻璃体腔内注射藏红花素明显抑制了实验性PVR的进展[39]。荷花碱(neferine)是从荷花的绿色种子胚中提取的双苄基异喹啉生物碱。研究发现荷花碱能通过阻断PI3K/AKT，p-p38MAPK和NF-ΚB信号通路，抑制EGF诱导的RPE细胞迁移和EMT；上调P21和P27表达导致RPE细胞周期在G1期停止，从而抑制细胞增殖[41]。淫羊藿苷(icariin，ICA)是中药植物淫羊藿的主要活性成分，既往研究报道ICA可以调节多种细胞的细胞周期进展和增殖。研究发现ICA可以通过影响细胞周期相关因子的表达水平，有效抑制PDGF-BB诱导的RPE细胞增殖[42]。岩藻多糖是从海藻类生物中提取出来的物质，实验证明岩藻多糖可以逆转TGF-β诱导的RPE细胞EMT过程,抑制TGF-β诱导的RPE细胞的迁移和收缩。体内实验研究组织学结果显示岩藻多糖抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)阳性的视网膜前膜形成，证明岩藻多糖可以抑制实验性PVR的进展[43]。上述研究表明这些天然类的物质能够有效的抑制ARPE-19细胞的增殖、迁移和EMT过程，从而影响PVR的发生发展。但是目前临床尚未见到这些物质应用于治疗PVR的研究实践，该物质对眼内的组织是否具有副作用仍需要大量的实验研究证实。

2.2临床药物研究者根据药理作用选择一些已经应用于临床的药物，研究其对于RPE细胞的作用。例如托格酮(troglitazone, TGZ)是一类用于改善胰岛素抵抗型糖尿病的新型口服降糖药。TGZ是过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的配体，有研究报道PPARγ的配体能够抑制细胞纤维的形成。Cheng等[44]研究了发现TGZ能够有效的抑制TGF-β诱导的Smad2，Smad3和p38 MAPK的磷酸化，从而抑制APRE-19细胞外基质的产生，抑制ARPE-19细胞迁移。依维莫司是mTOR抑制剂,已在不同的癌症临床实验中进行了研究，这种分子抗癌药物的副作用较小，所以研究者选择该药物用于眼部疾病治疗研究。Kuo等[45]研究结果证明依维莫司显著抑制RPE细胞中mTOR和RPS6的表达，抑制了RPE细胞的增殖，迁移。褪黑素(melatonin)是有效的抗肿瘤药物，有研究证实褪黑素能够抑制EGF诱导的ARPE-19细胞增殖，通过抑制组织蛋白酶S(cathepsin S，CTSS)的表达，阻止EGF诱导的细胞迁移。褪黑素激活AKT/mTOR通路抑制EGF诱导的ARPE-19细胞增殖和迁移，这依赖于CSTT对c-Jun/Sp1信号通路的调控[46]。硼替佐米(bortezomib)是第一种被批准用于复发难治多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂药物，一些研究报道了硼替佐米在眼科疾病方面的应用，如实验性葡萄膜炎、缺血再灌注损伤、青光眼滤过手术后纤维化和视网膜母细胞瘤。Moon等[47]研究表明硼替佐米20nM可以抑制RPE细胞的增殖和迁移以及通过抑制NF-κB信号通路，阻止TGF-β诱导的RPE细胞EMT过程。以上药物都能够阻断早期细胞反应，阻止RPE细胞的增殖和迁移，但是上述研究都局限于细胞水平，仍需要动物实验研究和临床试验研究去进一步验证上述药物对PVR的治疗效果。上述筛选的药物已经应用于临床且副作用较小，但是对于眼内应用的副作用以及进入眼内后的药物半衰期的长短都要进行大量的研究。若药物半衰期过短，则达不到治疗的效果，若加大药物的用量，其安全性能否得到保证这些都还不清楚。

2.3细胞因子PVR形成过程中与大量释放的细胞因子密切相关，所以抑制相关致病因子的释放可能会成为治疗或预防PVR的一种有效方法。但是，有研究发现一些细胞因子具有保护作用，可以阻止PVR的进展[48]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是多能性生长因子，体外实验证明BMPs可以维持RPE细胞的表型，缓解TGF-β诱导的RPE细胞迁移，EMT和胶原基质收缩。BMP7通过平衡TGF-β2/Smad2/3和BMP7/Smad1/5/9通路，抑制TGF-β2诱导RPE细胞EMT过程。通过兔PVR模型研究发现BMPs注射可以减轻兔PVR的进展[49]。此外，研究者发现一些致病的细胞因子，胰岛素样生长因子结合蛋白-6(insulin-like growth factor-binding protein-6,IGFBP-6)在PVR大鼠晚期的玻璃体腔，血清和视网膜中表达升高。在体外实验中IGFBP-6抑制胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ)诱导的ARPE-19细胞增殖和迁移。IGFBP-6与PVR的预后及严重程度有一定关系，该因子有望成为治疗或预防PVR的因子[50]。有研究表明在PVR患者玻璃体中发现高水平的IL-6，IL-6通过激活JKA/STAT3和NF-ΚB信号通路促进RPE细胞迁移和EMC合成，IL-6可能在PVR形成中发挥关键作用[51]，Chen等[29]研究进一步证实阻断IL-6/JAK/STAT3可以明显抑制RPE细胞的增殖和EMT,抗炎症可能成为治疗PVR的一种有前景治疗手段。Savur等[52]构建有色豚鼠PVR模型，实验结果证明治疗组和对照组相比视网膜中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1、IL-6和血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF)水平明显降低，研究发现玻璃体内注射英夫利昔单抗可降低细胞因子水平，抑制PVR的发展。EGF已被证明在RPE细胞的迁移增殖中发挥重要作用，近年来有研究证实，姜黄素在体内外均可以抑制RPE细胞增殖，抑制EGF的表达，从而有效的抑制PVR的启动和发展[53]。细胞因子疗法或许可以成为一种比较有前景的治疗方法。但目前针对细胞因子治疗的研究还不够深入，还需要更多的实验研究来证实该方法是否可以良好的治疗效果。

3展望

目前手术是治疗PVR的主要方法，但是结果仍令人不满意。研究结果表明，药物辅助治疗可减轻增生性疾病进程，提高手术成功率。一般来说，这些药理学策略包括抗炎、抗增殖、抗生长因子。阻断早期细胞反应是治疗PVR的一种比较有前景的治疗方法。研究已发现多种天然物质提取物和一些已经在临床使用的副作用较小的药物在干扰细胞增殖和抑制实验性PVR发生取得了良好的效果，但其在眼内的安全性及有效性仍需要大量研究去进一步验证。目前研究已经对PVR发生机制做了大量的研究，未来或许可以依据研究结果研发新型靶向药物来治疗PVR。当前筛选出的一些药物多局限于细胞和动物实验层面的研究，尚缺乏大量的临床试验研究，所以目前还没有一种正式应用于临床治疗PVR的药物。在未来我们可以继续开展深入研究，将上述筛选出的天然物质和药物应用于临床试验研究。