视网膜色素变性基因治疗的相关研究进展

邓方圆，韩梦雨，邓婷婷，金 明

0引言

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组以视杆和视锥感光细胞退化及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞变性为特征的遗传性视网膜疾病[1]。RP首发症状多为夜盲，随后是进行性视野丧失及视力下降等。眼底退行性表现通常包括视网膜骨细胞样色素沉着、视网膜血管变细及视盘蜡黄三联征。非综合征型视网膜色素变性15%～25%为常染色体显性遗传RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)，5%～20%为常染色体隐性遗传RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)，5%～15%为X连锁遗传RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)[2]。

RP发病、病情严重程度及进展与基因和遗传方式有关，受环境影响。基因治疗使用病毒或非病毒载体转移治疗性基因，对视网膜细胞进行遗传修饰，在基因水平上纠正遗传缺陷。视网膜为基因治疗提供了以下条件：(1)眼内结构高度分区，允许基因传递载体集中传递，约100μL体积内能够传递高达每个载体1.0×1010到2.0×1010个拷贝数[3]；(2)血-眼屏障避免基因载体眼外扩散，只转染眼部特定靶细胞，且不易引发全身副作用；(3)视网膜细胞群体稳定，非整合载体导入基因可持续表达。故而RP基因治疗具有独特优势及切实可行性。

1 RP基因治疗载体

基因治疗将外源性基因通过基因载体转染靶细胞，并得以稳定复制及表达。RP基因治疗载体主要分为病毒载体与非病毒载体。腺病毒(adenovirus，AD)和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是RP基因治疗研究常用病毒载体[4]。AD转导有效性高且运载量大。但AD某些血清型流行度高，部分患者携带中和性抗体，人体较高免疫原性限制AD基因治疗应用。AAV具有广泛转染性、较低免疫原性、较高转导效率及细胞特异性，可有效靶向RPE和视杆、视锥感光细胞，是目前RP基因治疗最常用递送系统。利用基因工程技术修改AAV衣壳，使AAV更适合RP基因治疗输送。Carvalho等[5]在小鼠和灵长类动物视网膜下注射Anc80L65-AAV变体，表现出高水平RPE和光感受器细胞靶向。为了优化转导效率，已分离出几种AAV衣壳，AAV2/1，AAV2/4和AAV2/6血清型有效转染RPE细胞[6]。尽管具有较高转染效率，但病毒载体免疫原性、致瘤性、致突变性不容忽视。非病毒载体可用较大基因片段转染细胞，且免疫反应风险较低，但缺乏使基因长期表达能力。Gallego等[7]基于微环DNA技术，有效提高阳离子脂质体在体外RPE细胞及大鼠视网膜基因转染效率。具体可根据各载体特点，针对致病基因亚型及患者情况酌情选用。

RP基因载体注射途径主要分为视网膜下注射和玻璃体腔内注射。多数RP基因治疗研究采用视网膜下注射载体，通过短暂视网膜脱离注入视网膜下空间以转染靶细胞。玻璃体腔内注射将基因载体注入玻璃体腔，避免视网膜脱离造成视网膜损伤。Davis等[8]证实玻璃体腔内注射对视网膜内或视神经疾病有效。Reid等[9]注射重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体rAAV2/2[7m8]及rAAV2/2[QuadYF+TV]突变嵌合载体rAAV2/2[MAX]于小鼠玻璃体腔内，光感受器转染效率明显高于单突变血清型。Khabou等[10]改造出玻璃体内注射耐受性良好AAV2载体，但对非人类灵长类动物光感受器渗透主要或仅在中心凹。

目前RP基因治疗研究多基于动物模型，少数ARRP(PDE6B、MERTK、RLBP1等)和XLRP(RPGR等)基因型临床试验正在进行。ADRP虽尚无相关临床试验报道，但ADRP最常见基因型RHO基因治疗相关研究较为热点。现总结RP常见基因型基因治疗相关文献，对RP基因治疗疗效及安全性研究进展予以综述。

2视网膜色素变性基因治疗

2.1 RHO 视紫红质基因(rhodopsin gene，RHO)编码参与视觉转导的光敏蛋白，为ADRP最常见突变基因，约占ADRP的40%[11]。RHO突变型RP患者多于20岁前出现首发症状，平均每年视敏度(visual acuity，VA)下降1.6%、视野(visual field，VF)丧失2.6%，于50～70岁失明。RHO特征性眼底改变多局限于1～2个象限，且伴发黄斑囊样水肿(cystoid macular edema，CME)，少数患者见广泛眼底改变。RHO基因P23H突变为首个确认RP相关基因突变，Mitra等[12]将短干扰RNA(short interfering RNA，shRNA)和野生型RHO与纳米颗粒一起输送到敲入型RhoP23H/P23H小鼠模型中，小鼠视觉功能出现部分改善。然而相关研究结果对比并非十分明显，或因RHO为活跃基因，在mRNA水平上干扰调节蛋白质水平具有挑战，故而基因组编辑技术成为ADRP基因治疗研究热点。Bakondi等[13]于RhoS334突变小鼠视网膜下注射常间回文重复序列丛集及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9)组件，小鼠视敏度增加53%，光感受器得以挽救。Latella等[14]将CRISPR/Cas9和针对RHO基因外显子1的3’和5’区域向导RNA(guide RNA，gRNA)注射表达RHOP23H小鼠模型视网膜下，成功降低突变基因表达水平。Tsai等[15]于小鼠视网膜下注射AAV2/8载体系统传递CRISPR/Cas9系统和外源RHO基因，3mo后联合消融置换基因治疗小鼠外核层(outer nuclera layer，ONL)厚度比单纯基因置换治疗小鼠ONL厚度增加约17%～36%，且视网膜电图(electroretinogram，ERG)a波和b波振幅更大。Cideciyan等[16]于RHOT4R/+犬视网膜下注射AAV-shRNA820-RHO820，13、17、27、37wk治疗区域ERG振幅a波、b波均较未治疗区域更大，形成显著对照。CRISPR/Cas9基因编辑可纠正常见RHO突变体(如P23H)，然而RHO基因有150多个突变体，针对所有突变形式的基因敲除与替换相结合或为有效疗法。RHO相关RP基因治疗于动物模型疗效显著，但ADRP暂无基因治疗临床试验报道，于RP患者有效性与安全性待确认。

2.2 PDE6B 视杆细胞环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)β亚基由PDE6B基因编码，可水解cGMP形成5’-GMP，是视杆细胞光信号转导激活关键酶。视杆细胞为主要受累细胞，PDE6B基因突变使感光细胞内cGMP增多，cGMP门控阳离子通道持续开放，阳离子高浓度毒性致使感光细胞坏死。PDE6B突变导致2%～5%的ARRP[2]，PDE6B突变型RP患者较早出现夜盲[17]，多于10岁前出现首发症状，主要病情变化为周边视野丧失，于高龄(80岁左右)出现CME、后囊下白内障(posterior subcapsular cataracts，PSC)及眼底色素沉着。CRISPR/Cas9技术利用单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)指导Cas9于靶基因座处形成DNA双链断裂(double-strand breaks，DSB)，断裂可非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或同源定向修复(homology-directed repair，HDR)。已被广泛应用的NHEJ技术基因编辑错误率相对高；HDR效率相对低且依赖细胞分裂，但为生殖细胞和增殖细胞基因编辑高保真途径。Cai等[18]在Cas9介导基因组编辑中添加靶向sgRNA的细菌重组酶A(recombinase A，RecA)蛋白，靶向PDE6B基因座外显子7，将终止密码子UAA更改为UAC，发现Cas9/RecA组小鼠存活视杆细胞数超过Cas9组5倍，Cas9/RecA组小鼠视锥细胞数增加超过Cas9组4倍，成功纠正点突变，挽救感光细胞变性，改善小鼠视觉功能，且体内外使用Cas9/RecA系统提高HDR效率均有效。但Pichard等[19]发现PDE6B-RP犬模型视网膜下基因治疗只有视网膜发育早期可实现。PDE6B基因治疗概念验证及安全性研究已在鼠及犬类动物模型完成。目前一项PDE6B基因治疗Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行，尚未发表研究成果，而已发表相关基因治疗结果对视杆细胞功能和结构评估不足[20]。

2.3 MERTK MER原癌基因酪氨酸激酶(MER proto-oncogene，tyrosine kinase，MERTK)与RPE顶膜感光细胞外段吞噬关键受体相关。MERTK基因突变使RPE细胞吞噬能力降低，中断视觉循环，使光感受器退化，导致约3%遗传性视网膜营养不良(inherited retinal dystrophy，IRD)[21]。MERTK突变型RP患者于20岁前出现首发症状及视野缺损，10～20岁VA降至20/200及以下，40岁左右失明。眼底病变可见眼球震颤、牛样眼黄斑病变及黄斑萎缩，未见视盘苍白相关报道。Ghazi等[22]已经成功在皇家外科医师学院(Royal College of Surgeons，RCS)视网膜营养不良模型大鼠视网膜下注射AD和AAV载体补充MERTK，延长大鼠光感受器细胞寿命周数。Lavail等[23]在RCS大鼠视网膜下注射RPE特异性AAV2载体(AAV2-VMD2-hMERTK)，大鼠ERG反应振幅随之增加，并于视网膜RPE细胞发现吞噬小体。Ghazi等[22]通过猴的临床前研究证实了试验安全性，并启动一项Ⅰ期非盲剂量递增试验，向6例MERTK相关RP晚期患者视网膜下注射rAAV2-VMD2-hMERTK，术后3例患者视力一过性的改善，无相关副作用及并发症，但2例患者视力改善2a后消失。MERTK基因治疗概念验证及安全性研究已在鼠及非人类灵长类动物模型完成，但Ⅰ期临床试验结果不甚理想，未来研究或需更关注基因治疗疾病及入组患者选择，并完善结局评价。即使已在动物模型充分验证，人体临床试验细节仍存在差异。

2.4 RLBP1 视黄醛结合蛋白1(retinaldehyde binding protein 1，RLBP1)基因于RPE和神经胶质细胞(Müller cell)表达11-顺式视黄醛结合蛋白，为视觉周期重要部分。RLBP1突变导致常染色体隐性视网膜色素变性，患病率地域差异大，部分偏远地区相对高。RLBP1突变导致感光细胞退化和RPE萎缩，Lima等[24]检测到无症状携带者也存在视觉周期缺陷。RLBP1突变型RP患者视野渐进性丧失，最终<5°中心视野残留，眼底可见白点状视网膜变性(retinitis punctata albescens，RPA)，少见或不见骨细胞样色素沉着。Choi等[25]于小鼠视网膜下注射AAV载体同时转染RPE和Müller细胞，发现小鼠视杆细胞暗适应速度改善。Maclachlan等[26]于小鼠模型证明在短启动子CPK850控制下AAV8载体携带RLBP1基因治疗有效性，但于小鼠、大鼠和非人类灵长类动物的临床前安全性研究显示眼内炎症和剂量依赖性视网膜变薄有所发生。RLBP1基因治疗概念验证及安全性研究已在鼠及非人类灵长类动物模型完成，进行中临床试验尚未发表改善视杆和视锥细胞视觉周期缺陷并稳定视网膜变性相关报道。

2.5 RPGR RPGR为视网膜色素变性三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)酶调节基因(GTPase regulator，RPGR)，为最常见引起XLRP基因，约占XLRP的70%～90%。RPGR突变型RP患者较早出现中心视野缺损，年均视野丧失4.7%～9%，多于45岁左右失明。眼底改变见黄斑萎缩，光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)显示椭圆体带年均缩窄175μm，ONL年均变薄250μm，早期即存在黄斑中心凹感光细胞外段厚度变薄，或为视力降低最大原因[27]。XLRP临床基因增强治疗试验主要集中在RPGR，尤其是占RPGR疾病70%以上的ORF15突变[20]。RPGR基因治疗于动物模型显示一定疗效，但RPGR固有序列不稳定性导致病毒载体克隆过程或发生不可预测重组错误。Fischer等[28]对RPGR基因进行密码子优化，使其具有良好稳定性和体外表达水平，来自密码子优化序列的RPGR蛋白中谷氨酰化模式与野生型没有区别，即密码子优化不会显著改变翻译后修饰。经AAV8载体递送密码子优化RPGR改善Rpgr-/y和C57BL/6JRd9/Boc两种小鼠模型表型，并在C57BL6/J野生型小鼠中表现出良好安全性。Song等[29]于野生型和突变小鼠进行了安全性研究，并解决了ORF15不稳定性问题。Hu等[30]将携带sgRNA和供体模板的AAV载体注射于6mo大Rpgr-/yCas9+/WT雄性小鼠视网膜下，注射后6mo和12mo于治疗视网膜区域观察到光感受器保留，与未治疗视网膜区域形成显著对照。Cehajic-Kapetanovic等[31]进行首个人类RPGR-XLRP基因治疗剂量递增试验，将密码子优化的人RPGR(AAV8-coRPGR)注射于18例患者视网膜下，6mo随访结果显示，全部18例患者治疗眼微视野平均增加0.5dB且OCT示ONL厚度增加，与未治疗眼形成显著对照，未发现明显剂量相关毒副作用或严重不良事件。RPGR基因治疗概念验证及安全性研究已在鼠及犬类动物模型完成，且首个临床试验初步结果证实RPGR-XLRP基因治疗有效性。另外两项Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行，但尚未发表研究相关结果。

3小结

遗传学技术的发展使更多RP相关基因被发现，也为基因治疗提供可能。RP基因治疗有效性于动物模型试验证实，几项临床试验正在开展且初步结果显示有较好疗效，为临床带来希望。然而在广泛实施前，必须克服重要挑战。比如基因载体改良、基因转移靶向性控制、基因表达产物调控等，以及治疗载体一次性给药是否能提供长期、持久临床益处等剂量相关问题尚不清楚。此外，基因治疗高度个性化治疗形式的昂贵经济成本也是推广重要阻碍。故而在正式应用于临床前，RP基因治疗仍有前路需要探索。