NLRP3炎性小体在脑缺血再灌注中的作用

郭艳芹，殷博凯，张 娟，何 治

(三峡大学 医学院， 湖北 宜昌 443002)

脑缺血(cerebral ischemia，CI)作为发病率最高的脑血管疾病，临床治疗仅为有限的静脉溶栓及血管内治疗以再通栓塞的血管。然而，随着缺血时间的延长，再灌注后往往会继发不同程度的脑损伤，即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)，严重影响患者的生存率及存活后的功能恢复。因此，从CIRI病生机制及调控策略入手，寻求新的治疗靶向及相关药物尤其迫切。

氧化应激、钙离子超负荷、线粒体通透性转换孔开放、血管内皮功能障碍以及炎性反应等多种病理过程参与了CIRI。中枢神经系统通过炎性小体的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别多种病原体和宿主衍生的细胞损伤信号，促进级联放大的炎性组织损伤。其中含有NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)蛋白并在其N端含有一个pyrin结构域(pyrin domain，PYD)的蛋白质3为胞内PRRs， 它形成的NLRP3(NODlike receptor protein 3)多蛋白复合物即为NLRP3炎性小体(NLRP3 inflammasome)。由于对NLRP3炎性小体探讨最为深入，因此，本文从NLRP3炎性小体的结构功能及活化相关机制入手，着重阐述脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)后它的负向调控机制，以期为CIRI后的靶向治疗提供坚实的理论基础。

1 NLRP3炎性小体

NLRP3是NLR蛋白家族中NLRP(NOD-like receptor protein)亚家族成员之一。激活后，它通过N端PYD与衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein，ASC)PYD相互作用募集ASC以及胱天蛋白酶1的前体(pro-caspase-1)，形成NLRP3炎性小体[1]。

1.1 NLRP3炎性小体的功能

NLRP3炎性小体的活化促进了下游促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟及释放，以及随后的快速的炎性溶解性程序性细胞死亡。它的异常活化参与了狼疮性肾炎[2]、败血症、腹膜炎[3]、结直肠癌肝转移[4]、阿尔茨海默病[5]等自身免疫性疾病、炎性疾病、癌转移以及神经系统退行性变等多种疾病的发生发展过程。

1.2 脑缺血再灌注(I/R)后NLRP3炎性小体的表达

NLRP3炎性小体的表达具有细胞特异性，主要表达在免疫器官及免疫细胞中，因此，脑I/R后小胶质细胞、星形胶质细胞中均有表达。而体外培养的神经元[6]及巨噬细胞[7]予以氧糖剥夺复氧模拟体内脑I/R后，检测NLRP3蛋白等炎性小体组分以及相关细胞因子的表达情况，也验证了它在脑组织及细胞中的分布和表达[6-7]。

2 NLRP3炎性小体的调控机制

NLRP3炎性小体可以通过3种途径即经典的、非经典的以及替代的途径来活化。其中，经典的活化途径是通过危险信号或病原体等启动核因子κB(nuclear-factor κB，NF-κB)转录，产生大量的NLRP3及IL-1β前体(pro-IL-1β)和IL-18前体(pro-IL-18)，在内环境紊乱、线粒体损伤致ROS的大量生成、溶酶体损伤等激活因素下，促进NLRP3炎性小体的组装及活化；非经典活化途径是由小鼠的caspase-11或人类的caspase-4和caspase-5介导的pannexin 1(panx1)通道开放引起钾离子流出，最终活化它的方式，如利什曼原虫膜糖结合物脂磷酸聚糖触发casepase-11并最终活化NLRP3炎性小体[8]；替代NLRP3炎性小体活化途径是由casepase-8等参与的活化途径，该途径研究较少，仍在初步探索中。由于经典的NLRP3炎性小体研究最为深入透彻，因而，本文主要围绕这一途径来阐述。

2.1 经典的NLRP3炎性小体的活化机制

NLRP3的基础表达水平对于炎性小体的活化而言太低，因此，需要启动刺激来转录NLRP3 mRNA并将该mRNA翻译成蛋白质，在激活剂的刺激下组装成NLRP3炎性小体，介导下游级联放大的炎性反应。所以，经典的NLRP3炎性小体的活化机制分为启动阶段和激活阶段两个过程。

2.1.1 NLRP3 炎性小体的启动:NLRP3通过识别不同的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和/或(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，促进NF-κB向细胞核内易位及转录，最终增加细胞内NLRP3、pro-IL-1β及pro-IL-18的表达，为后期激活阶段给予基本的物质条件。

2.1.2 NLRP3炎性小体的激活:NLRP3被激活剂触发后，转为有活性NLRP3，募集ASC和pro-caspase-1形成NLRP3炎性小体。炎性小体的形成促进了pro-caspase-1自我裂解成为活性caspase-1，后者将pro-IL-1β和pro-IL-18加工成为成熟的IL-1β和IL-18并释放，最终放大炎性反应并致使损伤后果加重。

2.2 NLRP3炎性小体活化的调节因子

NLRP3炎性小体对多系统疾病的影响越来越受到人们的重视，因而其活化的调节因子的探讨也成为了焦点。基于目前对其活化等相关机制的理解，探讨了多类调节因子，其中PKR、GBP5及NEK7被广泛认为参与了NLRP3炎性小体活化的调节，但调节机制及作用仍未完全阐述清楚，甚至存在争议，需要更加深入的研究来证实。

2.2.1 蛋白激酶R(protein kinase R， PKR):PKR是双链RNA(double strand RNA，dsRNA)依赖的蛋白激酶，为真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)之一，其N-末端含有两个dsRNA结合结构域(dsRNA binding domain，DRBD)，它通过DRBD与dsRNA或其他含DRBD的蛋白质结合。PKR通过与PACT(PKR的活化剂)结合使TAR RNA结合蛋白(TAR RNA binding protein,TRBP)对PACH的限制作用被解除而活化PKR，达到整合应激反应及诱导炎性细胞因子的作用，而木犀草素却能与PACT作用而使PKR 磷酸化抑制，消除对应激反应的整合及促炎细胞因子的诱导，却以不依赖PKR的方式增加炎性小体的活化[9]。而最近的研究发现，PKR参与了高糖中存活的视网膜内皮细胞中NLRP3激活，抑制PKR有效降低NLRP3炎性小体的激活，该作用是通过其上游的cAMP激活的交换蛋白(exchange protein activated by cAMP 1，Epac1)对PKR的磷酸化调节来实现的[10]。目前大部分研究表明，在大多数细胞中，PKR为NLRP3炎性小体的激活因子。

2.2.2 鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)：鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein 5，GBP5)属于GBP家族，涉及了囊泡运输、翻译等多种重要的细胞过程。它能激活NF-κB通路并通过与NLRP3的PYD相互作用促进ASC寡聚化，因此确定为NLRP3-ASC组装的独特活化剂，促进NLRP3炎性小体的组装[11]。在近几年的研究中证明了IFN诱导蛋白IRGB10在响应细菌感染过程中通过GBPS靶向介导革兰阴性菌破坏胞膜的稳定性释放炎性小体激活配体来活化NLRP3炎性小体，至于GBPS亚型尚不清楚[12]。 因此，GBP5对NLRP3炎性小体的正向调节效应尚待更多的实验来验证。

2.2.3 NIMA相关激酶 7(NIMA-related kinase 7，NEK7)：NEK7属于保守的NIMA相关的丝氨酸/苏氨酸激酶(NEK)家族，由于这个家族共有一个保守的N末端激酶结构域以及不同的C末端尾部，使得它们生理功能不同。NEK7在细胞有丝分裂中的作用已广为人知，而最近有学者通过一系列的实验证明NEK7响应于NLRP3的激活刺激与NLRP3蛋白的相互作用形成NLRP3-NEK7复合体作用于钾流出的下游增强NLRP3炎性小体的活化[13]。

3 脑I/R后NLRP3炎性小体的调控

脑缺血后机体氧气和能量的供应中断，再灌注后活性氧族(reactive oxygen species,ROS)的大量产生及细胞结构的破坏活化了NLRP3炎性小体并促使随后促炎细胞因子的大量释放，形成级联放大的炎性反应恶化CIRI的不良后果。因此，对脑I/R后NLRP3炎性小体的合理调控可以达到保护神经功能、改善预后的效果。

3.1 脑I/R后NLRP3炎性小体活化的启动调控

NLRP3是活化炎性小体的限速元件[14]，因而阻止NF-κB的转录可达到调控NLRP3炎性小体启动的目的。正常情况下，NF-κB被κB蛋白的抑制剂(inhibitor of kappa B，IκB)隔离在细胞质中，激活NF-κB途径以后，IκBα特定的丝氨酸残基被IkB激酶复合物磷酸化降解进而消除了其对NF-κB的限制，使NF-κB向胞核易位并与κB启动子序列结合，启动转录[15]。而在转录翻译后，则可以通过microRNA-20b直接靶向NLRP3蛋白或通过NLRP3炎性小体特异性抑制剂MCC950抑制小体活化的启动来调控脑缺血后的炎性反应[16-17]。

3.2 脑I/R后NLRP3炎性小体活化的激活调控

NLRP3炎性小体活化的激活调控在于抑制激活因素以及抑制小体的组装。在众多的激活因素中，找寻多种激活因素共同作用的下游通路有可能为开发出新一代的特异性抑制剂提供思路。

而通过抑制炎性小体组装来抑制其活化的并不多见，从CIRI方面着手的研究则更少。一方面，可以通过抑制NLRP3炎性小体各组分的形成及相互作用抑制其活化，如作用于NLRP3或抑制ASC斑点形成或抑制两者之间的相互作用等。酪氨酸激酶通过作用于NLRP3和ASC的物理作用，在体外以激酶活性依赖性方式诱导了ASC寡聚化和caspase-1活化从而活化NLRP3炎性小体，而其抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)在脑I/R模型中则通过抑制caspase-1的活化从而达到神经保护作用的目的[18]。NLRP3抑制剂CY-09能直接与NLRP3 NACHT结构域的ATP结合基序结合从而抑制NLRP3 ATP酶活性，达到特异性抑制NLRP3炎性小体的组装和活化的目的，其治疗效果在冷冻蛋白相关自身炎性反应综合征和2型糖尿病的小鼠模型中已经得到验证[19]，但在CIRI后治疗效果知之甚少。最近的研究表明，在应激条件下，应激颗粒和NLRP3炎性小体竞争DDX3X分子(应激颗粒蛋白的组分)，以决定ASC斑点的形成及随后NLRP3炎性小体的活化与否，最终决定细胞的存亡[20]。而杨梅素(myricetin)却通过泛素化修饰小体组分蛋白如NLRP3及ASC，同样也达到了抑制炎性小体组装的目的[21]。

另一方面，可以通过抑制NLRP3炎性小体活化的调节因子来抑制其活化。目前的研究表明，这种调控机制几乎作用于NLRP3炎性小体的激活机制上，即抑制它的组装，而对于其内部各组分蛋白的表达没有明显的影响。青蒿素(artemisinin)为一种广为人知的抗疟疾剂，在尿酸诱导的痛风模型中可以通过调节NLRP3与NEK7的相互作用抑制NLRP3炎性小体的活化进而达到抗炎的作用[22]。谷胱甘肽转移酶Omega-1(GSTO1-1)使半胱氨酸253上的NEK7脱谷胱甘肽化以促进NLRP3炎性小体激活，而其抑制剂则阻断了这一过程[23]。尽管这些机制为目前的研究提供了一些方向，但只是在某些模型中得到证实。

除此之外，姜根茎中外泌体样纳米颗粒阻断NLRP3炎性小体的组装，强烈地抑制其活化[24]，但其机制并不明确。虽然依据对其活化机制的理解，已经发现可以从许多的关键点上调节炎性小体的活化，但是在动物实验尤其是脑I/R后的研究仍有待学者进一步发掘。

4 问题与展望

脑I/R后炎性小体的活化参与CIRI后病理生理过程，加重了脑缺血后不良结局。目前的研究表明，除了NLRP3炎性小体外，其他炎性小体也参与了这一过程，究竟哪种炎性小体扮演着最重要的角色，各个炎性小体之间相互作用如何，仍需要后期进一步的研究来解释。而基于对NLRP3炎性小体的研究，由于目前在体内外实验中取得的进展仍难以应用到临床，因此，需要更多的实验支撑和更深入的研究成果来指导CIRI后的治疗，以期攻克CI不良预后的难关。