NETs与急性呼吸窘迫综合征的研究进展

王行行，王导新

(重庆医科大学附属第二医院 呼吸与危重症医学科, 重庆 400010)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是指各类非心源性因素引起，种种肺内或者肺外因素而导致的急性进行性呼吸衰竭。病理生理主要特征是肺毛细血管通透性增加、肺容量减少、肺部顺应性降低、严重通气/血流比例失调。最常进展到ARDS的疾病为脓毒症和肺炎。尽管近期ARDS治疗已经取得了巨大进步，高达45%的病死率依然使其成为人们广受关注的疾病。弥漫性肺泡损伤是重要病理特征之一，而中性粒细胞作为重要的免疫细胞，在此过程中起着至关重要的作用，了解它的具体作用机制有助于找寻ARDS的新治疗方法。

当病原体进入到机体中，中性粒细胞是宿主抵抗的第一道防线的重要构成成分。它可以通过吞噬内化胞外病原体、脱颗粒释放出多种具有免疫效应的蛋白质等方式来破坏病原体和清除感染。其中有一种新型的抗菌机制：中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，开辟了研究的新方向。中性粒细胞刺激后能产生一种以DNA为骨架，结合有相关组蛋白、颗粒蛋白和酶的物质，包括中性粒细胞弹性酶(neutrophil elastase，NE)、组织蛋白酶G(cathepsin G)、a-防御蛋白1-3(a-defensins 1-3)、NADPH氧化酶(NADPH oxidase)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)。多项研究表明，中性粒细胞胞外诱捕网在ARDS的病理生理过程中有关键作用，为ARDS的治疗带来新的希望，成为了近年来的研究热点。以下为NETs与ARDS的研究进展综述。

1 NETs概述

在各种病原体、钙离子[1]、佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)[2]、TNF-α、IL-1β等促炎物质[3]、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、组蛋白[4]和干扰素[5]等的刺激下均可诱导NETs形成。 NETs形成(NETosis)主要包括两种机制：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)依赖性和NOX非依赖性。

NOX依赖性：大部分研究都指出了这种方式。当中性粒细胞接受到刺激信号后，可以激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)随即激活位于其下游的信号通路Raf/MERK/ERK[2]，NADPH氧化酶活化从而产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS能够向肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylargin-ine deiminase 4，PAD4)等发送正反馈信号，组蛋白会被催化，发生瓜氨酸化，并且使得核染色体解聚。与此同时，钙离子内流，它是PAD4的辅酶，能够使染色体加速解聚。嗜天青颗粒是一种溶酶体，位于胞质，具有多种酶，它能产生中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，这是NOX依赖性的NETosis进程中必不可缺的两种物质。经过这一系列的反应后，中性粒细胞细胞膜支解，NETs释放到胞外。

NOX非依赖型：细胞外钙离子载体的内流，使得内质网ROS的产生。同时，钙离子载体可以调动位于细胞内的钙池，特别是位于内质网的钙池。尽管此种方式不依赖于NOX产生的ROS，但是钙离子载体会引起线粒体ROS的释放。

NETs可以捕捉、中和和杀死细菌、真菌、病毒和寄生虫，也能防止细菌和真菌的播散，但是过量的NETs生成会引起很多疾病。

2 NETs在ARDS发病机制中的作用

ARDS可以是肺内或者肺外因素引起，但这两种情况均有大量的中性粒细胞进入肺部这一特征。肺内疾病中肺部感染，是引起ARDS的重要原因，在肺炎患者中可以检测到NETs明显升高，并且高浓度的NETs与治疗、住院和康复时间延长，病死率的增加密切相关[6]。在脓毒症的患者当中，采用流式细胞术检测全血NETs的中性粒细胞的表面标志物和NETs的循环标志物，所有标志物与健康人相比均增高[7]。在无菌条件下，建立的外周组织创伤模型和化学因素引起的肺损伤模型中，线粒体DNA通过环磷酸鸟苷合成酶(GMP-AMP synthase，CGAS)与Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR 9)通路作用于中性粒细胞，产生NETs[7]。

2.1 NETs对肺组织的直接损伤

NETs的细胞毒性作用主要是由组蛋白介导的。在体外，上皮细胞和内皮细胞与组蛋白2A型的共孵育发现，组蛋白能抑制细胞增殖，并以浓度依赖的方式激发细胞毒性。如果破坏NETs的DNA骨架，不会改变NETs介导的细胞毒性反应。活化蛋白C(activated protein C，APC)可以减弱纯化体系中组蛋白诱导的细胞毒性，但并没有改变NETs诱导的细胞毒性，说明NETs中的组蛋白能被保护，防止被APC降解。

除组蛋白以外，NETs的其他成分也有直接损伤作用。髓过氧化物酶会破坏肺泡和支气管上皮细胞的DNA，中性粒细胞弹性酶具有的细胞毒性也能直接损伤肺上皮。

2.2 NETs对肺组织的间接损伤

NETs与各种炎性介质、免疫细胞可以相互影响，促进ARDS的炎性反应。NETs可以通过调节巨噬细胞的细胞类型分化方向，使得巨噬细胞向M1类型分化。临床实验中，ARDS患者的NETs含量与M1型的巨噬细胞水平正相关；动物实验中，在鼠的急性肺损伤组织中检测到NETs形成，且与BALF和肺组织中的M1型细胞增加和M2型细胞减少相关；体外实验中，在与高浓度NETs共培养的从骨髓提取的巨噬细胞(M0型、M2型)中，能检测到有意义的前炎性细胞因子的分泌和M1标志物的上调，M2标志物下调[9]。M1型细胞产生的炎性介质 IL-1β，TNF-α等均能引起NETs的生成。在脓毒血症诱导急性肺损伤大鼠模型中，可以检测出大量NETs和炎性介质，向小鼠注射DNA酶破坏NETs后，高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1，HMGB1)、IL-6、趋化因子 CXCL1 和趋化因子 CXCL2等脓毒血症相关性促炎因子均大幅下降[3]。

NETs与血小板之间有正反馈激活作用，这种正反馈作用促进了ARDS的进展。血小板上的TLR4与中性粒细胞上的配体结合，刺激中性粒细胞产生NETs，这个过程有部分原因是激活的血小板释放HMGB1，使中性粒细胞更倾向发生自噬和产生NETs；而NETs也可刺激血小板表达TLR4，并且在脓毒症中，存在促进血管内凝血和微血管功能障碍的调节轴：NETs-血小板-凝血酶[10]。依赖中性粒细胞提供的平台，血小板才得以向肺内聚集。

3 以NETs靶点对ARDS可能有治疗效果的方法

3.1 抑制NETs生成

加热灭活的胎牛血清、人的血清白蛋白、牛血清白蛋白均能抑制LPS诱导的NETs生成，其作用机制可能是通过减少中性粒细胞Ca2+向胞内流入有关[11]。通过高含量成像和分析的表型分析，发现野香草(vanilloids)能够抑制细胞内ROS的产生，从而抑制NETs生成[12]。组蛋白能以剂量依赖的方式激活NETs生成，且此机制不依赖于NADPH，石英晶体微天平系统分析发现，重组血栓调节蛋白能与组蛋白结合，抑制NETs生成[4]。在NETs产生过程中，PAD4等催化组蛋白发生瓜氨酸化而形成活性，瓜氨酸组蛋白H3(Citrullinated histone H3，CitH3)的单克隆抗体能够有效减少循环中的组蛋白H3，从而缓解由于脓毒血症引起的ARDS[13]。 DNA是NETs的骨架，用DNA酶(DNase)来抑制NETs形成也成为了近年来的研究热点，在人体的血浆和细胞(巨噬细胞)表面本身就存在的DNase能降解DNA，目前，在心脏和脑部形成梗阻性血栓时，DNase Ⅰ是一种基础治疗，那么当NETs在肺泡快速形成，导致急性肺损伤发生，吸入DNase Ⅰ或者静脉系统输注的方式可能也是有用的；此外，一项前瞻性、多中心、双盲的随机对照临床实验发现，雾化吸入一种重组DNA酶：阿尔法脱氧核糖核酸酶(dornase alfa)能够减少创伤因素导致的急性肺损伤[14]。纳米颗粒介导的西韦司他(sivelestat)可以减少血清中NE和其他的前炎性细胞因子和NETs生成，减轻肺损伤的临床表现[15]。间质干细胞、宿主内皮来源的p33均能抑制NETs的生成[16-17]。

3.2 对抗NET的毒性作用

血浆中自然存在的唾液酸可以减少NETs的影响，多聚唾液酸可以对抗所有种类的组蛋白的毒性作用，并且这种作用与唾液酸的聚合程度相关[18-20]。NETs会抑制肺表面蛋白形成过程，肺表面蛋白对维持肺泡表面张力具有重要作用，从而引起肺泡塌陷，肺表面活性蛋白D(surfactant protein-D，SP-D)可以逆转这种作用，同时它也可以减少LPS引起的NETs形成[21]。

3.3 其他

血必净是一种传统中药制剂，注射使用是治疗脓毒症的一种方法，其中3个主要活性成分包括：红花黄色素A(safflor yellow A (SYA))、羟基红花黄素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)和无水红花黄素B(nhydrosafflor yellow B，AHSYB)。用腹腔内注射LPS来形成小鼠急性肺损伤模型，然后给予SYA、HSYA和AHSYB 3种物质进行治疗。病理组织学的结果提示，SYA、HSYA和AHSYB都可不同水平地减轻肺损伤程度。在免疫荧光实验中，这3种物质还显著减少了髓过氧化物酶(MPO)和组蛋白，降低了血浆中MPO-DNA复合物的水平。用PMA刺激HL-60细胞进行体外实验，也显示了类似的趋势，3种成分抑制了PMA诱导的类中性粒细胞HL-60细胞释放NETs。Western blot结果显示，经SYA、HSYA和AHSYB处理后，LPS刺激小鼠和PMA处理的HL-60细胞中Raf激酶、丝裂原活化蛋白激酶ERK激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化均显著降低。因此血必净的3种成分SYA、HSYA、AHSYB对LPS诱导的肺损伤和NETs释放均有保护作用[22]。

有氧运动作为一种锻炼方式，它能够减轻急性肺损伤时的肺部炎性反应程度，主要通过参与ERK1/2和NF-κB通路，抑制过量NETs释放，减少肺泡巨噬细胞的促炎极化，从而减轻在急性肺损伤时的炎性反应[23]。

4 问题与展望

研究者们经过近50年的探索，急性呼吸窘迫综合征的机制研究业已获得了重大的突破，但是目前仍然没有研制出有效的治疗药物，病死率依然居高不下。NETs在它的发展过程中起着重要作用，近年来成为了研究热点，NETs可能成为一种新的治疗方向。NETs对机体也有一定的保护作用，可以包裹杀灭病原体，然而，如果完全阻断生成或者其作用，可能会影响人体的免疫水平，因此寻找一个平衡点，应是未来研究的方向。