五酸钾对酸雨胁迫伤害香青菜的缓解效应*

谢恩耀，卫 慢，陈俊彤，朱志平，袁振兴，张 颖，钱加越，金 琎**

五酸钾对酸雨胁迫伤害香青菜的缓解效应*

谢恩耀1,2，卫 慢1，陈俊彤1，朱志平1，袁振兴1，张 颖1，钱加越1，金 琎1**

（1．苏州科技大学化学生物与材料工程学院，苏州 215009；2．上海微谱化工科技有限公司，上海 201403）

采用人工模拟酸雨的实验设计，以国家农业地理标志产品香青菜（L.）为实验材料，以叶片喷施蒸馏水为对照（CK），设置直接喷施pH3.0的酸雨（SY）和10mg·L−1浓度五酸钾溶液预处理后再喷施pH3.0的酸雨（WS）两个处理组。测定并比较分析各处理组香青菜根系活力、质膜透性（MP）、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧阴离子自由基产生速率和脯氨酸（PRO）含量，研究酸雨胁迫对香青菜主要生理指标的影响和五酸钾对酸雨胁迫伤害香青菜的缓解效应，从而探索五酸钾对酸雨胁迫下植物幼苗的防护效果。结果表明，叶面喷施浓度10mg·L−1的五酸钾溶液能够显著提高酸雨胁迫下香青菜根系活力、CAT活性，保护了细胞质膜，有效降低香青菜体内PRO含量及超氧阴离子自由基产生速率。说明五酸钾可缓解酸雨对香青菜的生理伤害，对提高香青菜抗酸雨伤害能力具有优良效果。

香青菜；酸雨胁迫；五酸钾；理化指标；化控减灾

酸雨污染发端于18世纪60年代的英国产业革命时期，其后拓展到欧洲、北美等地区。伴随着工业化进程的加速，中国已跃然成为世界第三大酸雨区，年酸雨平均出现频率高居全球第二且酸雨区面积达到总国土面积的12.6%[1]。酸雨对于中国农业发展的影响已经到了不容忽视的地步，其对农作物生长影响巨大，已有研究报道，酸雨可引起作物生理紊乱、生长不良、减产乃至死亡[2-5]。筛选培育抵御酸雨伤害的抗性作物品种，并采取一定的化控减灾手段就显得尤为必要。相较于新型作物品种筛选的漫长周期，当下使用外界化学防控手段在时间及效果上更为显著，能够更好地调节作物生理功能、增强作物抗逆性。因此，见效快、成本低的化控减灾手段，更符合中国农业生产实际。

以往研究过程中，化控减灾对农作物生长发育亦取得了不菲的成就。常青山等研究指出，在高羊茅[(Shreb) Darbysh.]种子发芽过程中添加适当剂量Ca2+浸种可减轻模拟酸雨对种子发芽势和发芽率的影响[6]；唐丽发现，在酸雨胁迫过程中多种苗木脯氨酸（PRO）含量随着酸雨pH值下降而大幅增加[7]，因此，PRO可以作为验证酸雨胁迫下植物生理活动的一个重要指标；金琎等研究显示，La3+可以有效缓解酸雨对玉米（L.）幼苗产生的不良影响，对酸雨胁迫下玉米幼苗根系、叶片生长起到促进作用[8]。使用La和Ce可减轻酸雨对供试植株代谢生理的损害，促进植株幼苗光合、呼吸作用并能有效提高抗氧化保护酶活性[9]。张玉涛等研究表明，除稀土外，多数抗酸雨胁迫的化学产品均含有络合基团，有机物分子中配位官能团根据络合能力的大小参与反应，从而对酸雨胁迫下的植株起到一定保护作用[10]。

稀土作为战略储备资源，将其用于农业生产的效价比相对较低，因此，寻找可替代的抗酸雨胁迫化学调节剂迫在眉睫，而新型化合物五酸钾含有多个羧基与丰富的络合基团，五酸钾可吸收H+，释放移动性较强的K+，同时能稳定细胞内金属元素[11]。因此，从结构及原理上推测，五酸钾能缓解一定强度酸雨对植物造成的胁迫伤害。

为此，本研究采用模拟酸雨（pH3.0）进行实验设计，以国家农业地理标志产品香青菜（L.）为实验材料，运用生理生化实验技术，从细胞抗氧化伤害视角，初步研究酸雨胁迫对香青菜根系活力、质膜透性（MP）、过氧化氢酶（CAT）活性、氧自由基产生速率和脯氨酸（PRO）含量等5种生理生化指标的影响，以及喷施五酸钾（10mg·L−1）对酸雨胁迫伤害香青菜上述指标的缓解效应，以期为酸雨危害的化控减灾技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 试材培养

选用香青菜（L.）品种为黑叶香青菜，将其种子在质量分数为0.1%的氯化汞中消毒5min，后经去离子水冲洗，吸干表面水分，置三层纱布培养皿中，在恒温培养箱中（温度为26±1℃）萌发[12]。约7d后，待其根长达3cm时移入黑色塑料杯（直径10cm）中并转入光照培养室培养。

培养室温度为25±3℃，光子通量密度为2000μmol·m−2·s−1，光暗比12h/12h，每杯2株，每2日换水一次[12]。至第二片真叶出现，改用1/2Hoagland营养液进行培育，早晚各通气一次，并用去离子水补水以保证生长过程中水分充足，每3d更换一次培养液，培养30d后用于试验处理。

1.2 试材处理

根据文献[13]，按照SO42−:NO3−=4.8:1的体积比配制成浓度为1.0mol·L−1的AR母液，充分研究苏州市土壤缓冲极限和机动车尾气等外界条件影响[14-17]，最终在培育过程中在母液中加入蒸馏水经PHS-29A酸度计调节pH=3.0，以此溶液作为模拟酸雨。

五酸钾（Potassium pyridine- 2,3,4,5,6 –pentacarboxylate），由苏州科技大学化学生物与材料工程学院提供，其结构式为

前期预实验已筛选出10mg·L−1浓度的五酸钾对植物幼苗萌发具有最为显著的效果，因此配制10mg·L−1五酸钾溶液向香青菜喷施，以验证对幼苗的酸雨防护效果。

选取萌发长势一致的香青菜对其处理，共设置3个处理组，每个处理组设置5个平行处理，每个平行处理10株幼苗。对照组（CK）采取蒸馏水预喷施，24h后对其采用蒸馏水喷施处理；酸雨组（SY）采取蒸馏水预喷施，24h后对其采用pH=3.0的酸雨喷施处理；五酸钾（WS）组采取10mg·L−1的五酸钾溶液预喷施，24h后对其采用pH=3.0的酸雨喷施处理，每次喷施均宜将叶片全部打湿，用液量约为15mL。

对香青菜进行酸雨喷施处理24h后作为实验第1天（记为1d），即开始相关指标测试，测试过程中分别对5组平行样品进行同等测定，每组样品设置3组平行以减少误差，后续第6天（6d）、第11天（11d）、第16天（16d）分别测试并记录相关生理指标。

1.3 指标测定

1.3.1 根系活力测定

选取香青菜幼苗根尖约5mm，单次采样0.2g，在0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液中暗反应3h，以1mol·L−1硫酸终止反应，研磨后用乙酸乙酯定容，在485nm下比色，测定根系活力[18]，当3组平行样的RSD≤15%时，取其均值进行数据统计，否则重新测定。

1.3.2 质膜透性（MP）及过氧化氢酶（CAT）活性测定

香青菜叶洗净去叶脉后采用叶片打孔器制成1mm2左右叶片碎片，0.15g叶片放置在7mL去离子水中在抽真空环境下保持10min，通过电导率测定法对其MP参数进行测定[18]。利用H2O2在240nm处吸收的原理，将0.3g叶片在pH=7的缓冲液中充分研磨后取上清液，加入H2O2采用紫外吸收法对CAT活性进行检测[19]。

1.3.3 超氧阴离子自由基产生速率及脯氨酸（PRO）含量测定

超氧阴离子自由基产生速率的测定过程参照羟胺氧化法[19]，实验过程中称取1g叶片充分研磨，将提取液和磷酸缓冲液、盐酸羟胺充分反应，在加入对氨基苯磺酸和α-萘胺水浴后在530nm波长下测定其OD值用以得出超氧阴离子自由基含量；脯氨酸含量的测定参照茚三酮法[19]，取0.5g叶片充分研磨取其上清液，加入冰醋酸和酸性茚三酮水浴加热，后续加入甲苯，在520nm处测定PRO含量。

1.4 数据统计与处理

数据处理采用SPSS 22计算平均值、标准差和相对值，单因素方差分析其差异性，最小显著性差数法（LSD）进行显著性检验，用Excel绘图。

2 结果与分析

2.1 五酸钾对酸雨胁迫下香青菜超氧阴离子自由基产生速率的影响

超氧阴离子自由基过度积累会造成植物体膜脂的过氧化作用，阻碍核酸合成，给植株造成不可逆转的伤害[20]。从图1可以看出，氧自由基产生速率随着香青菜的生长发育总体呈现逐步升高的趋势，在11d和16d时，酸雨组（SY）的氧自由基产生速率出现异常升高的现象，分别达到对照组（CK）的135%、142%，五酸钾组（WS）的121%、114%，而随着五酸钾的施加，香青菜体内氧自由基产生速率得到了较为显著的抑制（11d和16d）。

由此可见，随着香青菜生长发育的后延，香青菜机体自身亦会衰老，因此氧自由基产生速率会随着时间的增长而逐步增加，与此同时，酸雨胁迫环境对香青菜产生了一定程度的不利影响，加速了植物体的衰老进程。而五酸钾的喷施则有效降低了香青菜机体中氧自由基的产生速率，虽然相较于对照组依然差异显著，但总体来说五酸钾依然起到了良好的保护作用。

注：小写字母表示处理间在0.05水平上的差异显著性。下同。

Note: Lowercase indicates the difference significance among treatments at 0.05 level. The same as below.

2.2 五酸钾对酸雨胁迫下香青菜质膜透性（MP）的影响

细胞质膜是植物进行营养吸收和代谢废物排放的一条重要通道，能够辅助细胞更好地维持体内的离子平衡，在植物体内具有不可替代的作用[20]。在1、6、11和16d时，五酸钾组（WS）MP分别为对照组（CK）的83.57%、95.56%、71.80%、90.54%，为酸雨组（SY）的80.62%、116.89%、51.59%、82.72%。从图2可以看出，喷洒初期，酸雨并未对香青菜的MP产生较为显著的影响，甚至6d时酸雨组（SY）电导率还有着较为显著的降低。而在11d和16d时，五酸钾组（WS）相对电导率均维持在相对较低的水平，而与此同时酸雨组（SY）的电导率则显著高于对照组，达到了对照组的129.8%和117.6%，说明五酸钾对细胞质膜具有可靠的修复作用，缓解了酸雨胁迫对香青菜细胞膜的损伤。

2.3 五酸钾溶液对酸雨胁迫香青菜根系活力的影响

根系活力是衡量植物根系生理状况、影响植株生长的重要指标[21]。图3显示，酸雨组（SY）喷洒酸雨1、6、11和16d时，香青菜苗的根系活力分别为对照组（CK）的55.70%、30.69%、30.83%和28.80%，酸雨对香青菜幼苗根系伤害显著。而五酸钾处理组（WS）其1、6、11和16d时根系活力均显著高于酸雨处理组（S）（P<0.05），分别为酸雨组的190.37%、318.74%、352.81%和476.56%，且与CK处理中的根系活力水平基本一致，分别为对照组的106.04%、97.82%、108.77%和137.25%，差异均不显著。说明喷施五酸钾溶液对酸雨胁迫伤害香青菜有明显缓解作用，且防护效应随处理时间延长而增强，五酸钾的施加达到了对香青菜根系保护的目的。

2.4 五酸钾对酸雨胁迫下香青菜过氧化氢酶（CAT）活性的影响

CAT主要功能是对体内生理活动过程中产生的过氧化氢进行分解与清除，对细胞膜起到更好的保护作用，以减少植株体内产生的过氧化现象[22]。从图4可以看出，酸雨组香青菜幼苗CAT活性出现了显著的降低，而五酸钾处理组不仅对酸雨胁迫的这种现象有所缓解而且还产生了更为优异的表现，五酸钾组香青菜幼苗体内的CAT活性得到了显著的提升，从而使得植株能够更好地清除体内多余的过氧化氢。图4表明，在1d和6d时，酸雨组（SY）CAT活性与对照组（CK）和五酸钾组（WS）产生差异显著，相较于二者分别升高了127.74%和43.79%，表明植物机体已经对酸雨胁迫环境作出了相关应答。到实验后期(11d和16d)，酸雨组（SY）CAT活性显著降低，五酸钾组的CAT活性显著提高，五酸钾组的CAT活性为对照组的137.53%和140.33%，且达到了酸雨组的5.44倍和10.57倍。说明五酸钾能够很好地预防酸雨胁迫超过植物体自身应答阈值范围，从而更好地用作农作物生产的化控减灾。

2.5 五酸钾对酸雨胁迫下香青菜脯氨酸含量（PRO）的影响

脯氨酸是一种相溶性渗透调节物质，在植株内能有效缓解细胞渗透压异常的状况，保护和提高酶类的生物活性，增强胞内稳定性[23]。由图5可见，香青菜幼苗体内PRO含量总体呈现下降趋势，结合上文结果分析可以推断，香青菜幼苗生理生化活动受酸雨胁迫影响依旧处于其应答阈值范围，酸雨所造成的胁迫效应在体内的抗氧化酶系统如CTA酶等调控下暂处于动态平衡。从图5还可以看出，受到酸雨胁迫影响，酸雨组（SY）PRO值较对照组普遍出现了较为显著的上升，而五酸钾组（WS）则出现了显著的降低，在16d时，五酸钾组（WS）PRO含量分别是对照组和酸雨组的84.66%和81.85%。由此判断，五酸钾的施加可以为植物幼苗营造一个更加稳定的内环境，从而减少PRO的产生。

3 结论与讨论

3.1 讨论

受酸雨胁迫影响，酸雨组香青菜幼苗机能总体呈现下降趋势。相较于对照组其超氧阴离子自由基产生速率、MP和PRO含量出现了较为显著的增长，而香青菜根系活力和CAT活性均出现了显著的降低。

植物体生理活性始终保持在一个动态平衡的过程中，本研究结果与王章艳等研究中的变化趋势具有一定的相似度[13]，酸雨对植株幼苗的生理代谢过程产生了一定的氧化作用，从而造成植株体内超氧阴离子自由基含量显著升高，而五酸钾能够提供羟基基团从而与部分氧化物质形成稳定的络合物，在减少氧化物的同时能够对植物细胞形成较为有效的防护层，从而有效提高植株的抗逆性。

酸雨胁迫随着时间的推进开始从叶片向幼苗植株各个部位转移，其积累的氧化物和胞内外渗透压的变化对植物体的细胞产生伤害，进而植物体的MP会产生升高的现象。而本研究结果表现出先扬后抑的现象，与罗子渝等对冬青叶片中MP表现结果相悖[24]，这种现象出现的原因与植物体自身所具有的抗逆性有着一定的关联性，培育过程中当酸雨胁迫环境未超出植物体自身修复作用的阈值时，植物自身会进行一定程度的应答反应[25]，本研究MP值在6d时出现峰值，随后出现回落，随着培育时间的延长，植物体转运作用的影响下，喷施在叶片的酸雨被大幅转运到根部，被植物体充分吸收从而造成植株体内生理环境紊乱，细胞质膜出现破裂，进而16d时MP又出现小幅上扬的现象，随着研究时间的进一步延长，MP值变化趋势与罗子渝等的研究结果相类似。

研究中根系活力在11d和16d时出现迅速降低的现象，分析原因是水培香青菜在超过30d会出现烂根的现象，因此后续实验设计需增加通气频次。

随着MP的提高，植株体作出了相应的应答，即进一步提高CAT活性及PRO含量来应对细胞内外渗透压的变化，随着培育时间的延长，为了应对体内代谢过程中所产生的氧化离子，消灭此类氧化物，香青菜幼苗体内CAT活性总体变化趋势呈现逐步升高的趋势，酸雨胁迫环境对这一生理过程产生了较为显著的抑制作用，酸雨组CAT酶活性的降低是由于酸雨中的硫酸根离子氧化了环境中的部分离子，对CAT酶的关联表达基因有着一定程度的抑制，最终造成CAT酶活性异常降低的现象。姚梦婕等相关研究发现[26]，施加少量稀土元素可以有效降低CAT酶活性，强烈的环境胁迫会致使细胞受损从而激发CAT活性。本实验研究结果与其相反，综合对照组CAT活性变化情况分析，造成此种结果的差异极大原因是由于不同实验材料所造成的，香青菜对照组的CAT活性随着时间的变化不断增加，结合前人研究判断，香青菜CAT活性依然处于植物自身阈值范围[12]，五酸钾的施加在其细胞阈值范围内进一步增强了CAT活性从而更好地清除酸雨所造成的部分氧化物质，且在此借鉴林星谷等早年的研究成果，过氧化氢酶的关键表达基因在植株根、茎、叶、果之中均有不同程度的表达，但其在叶中的表达最低[27]，因此会造成一定的不利影响，从而使酸雨并未达到香青菜幼苗自身的应答阈值。因此，根据上述实验结果可推断五酸钾的施加可以对香青菜抵抗酸雨胁迫起到有效的保护作用。

由五酸钾处理组香青菜生理生化指标的变化可知，其CAT酶的活性有着十分显著的提高，加强了植物体对酸雨胁迫的应答反应，究其原因，本实验过程中所使用的新型化合物五酸钾，其富含羟基基团，易发生络合反应，可推断当五酸钾量达到一定浓度时，其能够与重金属离子产生强烈的络合作用，从而形成性质稳定的络合物改变环境离子的特性，在更好地对植物组织细胞提供保护作用的同时，亦是将CAT酶关键基因的阻遏离子给予清除从而使得其更好的表达，随着CAT活性在香青菜阈值范围内的不断升高，香青菜幼苗体内ROS得以更好地清除，因酸雨胁迫而受损组织得到防护并逐步修复，使得机体内的氧自由基产生速率相较于酸雨组有着较为明显的降低。与此同时MP指数有所下降，进一步联动PRO含量降低。同时，五酸钾对环境中的H+具有一定程度的交换作用，该过程中释放出移动性较强的K+，从而弥补酸雨导致的大量K＋流失对植物造成的营养元素的匮乏，以此来提高植物幼苗的环境抗性。

PRO相关研究结果与王艳章等在对水稻研究过程所得结果有所出入[13]，但其用于维护植株体胞液平衡过程的作用原理与谢恩耀等研究所使用的植物生长调节剂相类似[28]。究其原因，五酸钾中K+的释放使植物体细胞内缓冲区间变大，加上抗氧化酶系的不断作用使植物细胞内外渗透压区域在一个较为稳定的波动区间内，因此PRO才会出现显著的降低，从而更好地提高植物的抗逆性。

3.2 结论

（1）酸雨污染对香青菜幼苗产生显著伤害，根系活力、CAT活性显著降低，MP、PRO含量、超氧阴离子自由基产生速率显著升高；（2）喷施五酸钾可明显缓解酸雨对香青菜幼苗的不利影响，其根系活力、CAT活性、MP、PRO、氧自由基产生速率在五酸钾的作用下逐步恢复，能够很好地提高植株幼苗自身的抗逆性；（3）五酸钾缓解酸雨对香青菜生理伤害之效应，为酸雨危害的化控减灾提供了一条新思路。

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Mitigative Effect of Pyridine-2,3,4,5,6-Pentacarboxylate on theL. under Acid Rain Stress

XIE En-yao1 2, WEI Man1, CHEN Jun-tong1, ZHU Zhi-ping1, YUAN Zhen-xing1, ZHANG Ying1, JIN Jin1

(1. School of Chemical Biology and Materials Engineering, Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009, China；2. Shanghai Weipu Chemical Technology Co., LTD, Shanghai 201403)

In this paper, the simulating acid rain (pH3.0) pollution was used,L., a national agricultural geographical indication product, regarded as the model material. The leaves which were sprayed distilled water regard as the control (CK). One treatment is the leaves were sprayed of pH 3.0 artificial acid rain (SY). Another treatment is the leaves were sprayed with 10mg·L−1Pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate solution and pH3.0 artificial acid rain (WS) in sequence. The root activity, plasma membrane permeability (MP), catalase (CAT) activity, oxygen free radical producing rate and proline (PRO) content were studied under the condition of acid rain stress and pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate protection. The results showed that the leaf which sprayed 10mg·L−1pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate solution could significantly improve the root activity and CAT activity, protect the cytoplasm membrane, and effectively reduce the PRO content and oxygen free radical production rate in broccoli under acid rain stress. The comprehensive comparison shows that pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate have a positive effect on relieving the physiological damage under the acid rain stress and improving the ability of resisting acid rain.

L.；Acid rain stress; Pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate; Physical and chemical indexes; Chemical control and disaster reduction

10.3969/j.issn.1000-6362.2021.03.005

谢恩耀,卫慢,陈俊彤,等.五酸钾对酸雨胁迫伤害香青菜的缓解效应[J].中国农业气象,2021,42(3):213-220

2020−08−25

苏州市科技计划项目（SYN201413）；江苏省教育厅“高等学校大学生实践创新训练”（601630002）

金琎，副教授，研究方向为植物逆境生理学，酸雨、重金属等对植物的损伤及其修复，E-mail: 871564458@qq.com

谢恩耀，E-mail:editortak@163.com