迷迭香酸干预PI3K/Akt信号通路保护缺氧/复氧损伤血脑屏障功能的影响*

陈鹏，瞿晶田，王婧斯

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.盈科瑞（天津）创新医药研究有限公司，天津 300385）

血脑屏障（BBB）是脑毛细血管阻止某些物质由血液进入脑组织的结构[1]。神经元在正常活动时，需要非常稳定的内环境，而这种稳定性的实现，有赖于BBB的存在。研究显示，脑缺血再灌注损伤时，BBB不仅有结构的损伤和改变，也出现功能异常，即通透性改变、转运功能破坏等[2]。同时，BBB功能性开放又导致外周有害物质的渗入，引起继发性脑损伤[3]。脑微血管内皮细胞（BMEC）是构成血脑屏障的主要结构[4]，BMEC一面与血液接触，一面与脑细胞连接，保护神经元免受血液中潜在有害物质的损害，其细胞间的紧密连接是BBB模型的一个重要特征[5]。目前BMEC体外培养模型已经被广泛应用于BBB的研究。

迷迭香酸（RA）是一种水溶性的天然酚酸类化合物，广泛存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[6]。目前，对RA在脑缺血后的保护作用报道较少，尤其在RA维持脑缺血后BBB功能方面尚未见报道。因此，本研究体外原代培养大鼠BMEC，以氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）损伤，模拟在体脑缺血再灌注损伤的BBB模型。通过检测细胞活力、乳酸脱氢（LDH）漏出、跨细胞间电阻（TEER）值，异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖透过，罗丹明 123（Rh123）蓄积等指标，明确RA对OGD/R损伤BMEC的保护作用；通过检测紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达，证实RA可以维持脑缺血后BBB的功能；通过p-Akt/Akt蛋白表达及抑制剂的应用，初步考察RA对BBB功能影响的可能的上游机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 迷迭香酸（RA，质量分数＞98%），上海源叶生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS），北京索莱宝科技有限公司；Ⅱ型胶原酶、胶原酶/分散酶、内皮细胞生长因子（ECGF），Roche公司；CCK-8试剂盒，同仁化学；LDH试剂盒，Promega公司；异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖，Sigma公司；PrimeScript TMRT 试剂盒、SYBR誖Premix Ex TaqTM，TaKaRa 公司；p-Akt、Akt抗体，CST 公司；β-actin、ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；LY294002抑制剂，Calbiochem公司。

1.2 动物 Wistar大鼠，20日龄，体质量（40±5）g，雌雄不限，共计购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 仪器 低温离心机，美国Beckman公司，酶标仪，美国，MD公司，PCR扩增仪，美国，Bio-rad公司，实时荧光定量系统，美国，Bio-rad公司，凝胶成像系统，美国，Bio-rad公司。

2 方法

2.1 脑微血管内皮细胞培养 参考文献[4]，将Wistar大鼠脱颈处死，置于75%乙醇中浸泡3～5 min消毒。取出全脑，置于冷的D-Hank’s液中，去除小脑、间脑、血管、软脑膜等，保留大脑皮质。用眼科剪将脑组织剪成约1mm3碎片，加入0.7mg/mL Ⅱ型胶原酶，37℃消化 1h，1000×g离心 10min，弃上清液，加 20%BSA混匀，1 000×g离心20 min，保留底层沉淀。再加入 1 mg/mL 胶原酶/分散酶，37 ℃消化 1 h，700×g离心6min，弃上清液，DMEM液漂洗2次，加入DMEM全培基（含 20%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、30 μg/mL ECGF、100 μg/mL肝素钠）重悬细胞，接种于 75 cm2培养瓶中，2 d后换液，单层BMEC融合至70%～80%时传代。用消化液（0.25%胰酶和0.02%EDTA组成）消化，轻轻吹打成细胞悬液，1 000×g离心5 min，弃上清液，加入DMEM全培基重悬，种于培养板中。

2.2 分组及处理 将传代的BMEC密度调至4×105/mL，根据实验需要分别种于96孔板、6孔板及Transwell套筒上，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2 d换液1次。待细胞融合时分为5组：对照组（Con），加入全培基，正常孵育 24 h；模型组（OGD/R），加入平衡盐溶液，置于95% N2-5% CO2条件下缺氧培养6 h后，置换为全培基，正常孵育18 h；RA组，分别加入终浓度 2.5、5、10 μmol/L RA 的平衡盐溶液，置于95%N2-5% CO2条件下缺氧培养6 h后，置换含 2.5、5、10 μmol/L RA 的全培基，正常孵育18 h。抑制剂组，提前给予20 μmol/L LY294002孵育1 h后，处理方法同其他组。

2.3 CCK-8试剂盒检测细胞活力 细胞分组处理后，弃上清液，培养板中每孔加入100 μL含10% CCK-8的DMEM培养液，37℃孵育30 min，酶标仪450 nm波长检测各孔吸光度（A）。

2.4 LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶漏出量 细胞分组处理后，吸取25 μL的上清液于96孔板中，加入25 μL CytoTox-ONETMReagent，于 22 ℃孵育 10 min后，加入 12.5 μL Stop Buffer，振荡 10 s，于激发波长560 nm，发射波长590 nm处检测荧光值。

2.5 跨细胞间电阻的测量 BMEC种于套筒内侧，每天固定时间测定细胞间电阻值，即将电阻仪电极分别插入Transwell小室内外侧，待电阻值达到稳定后可用于实验。细胞分组给药处理后，再测量每组TEER值。

2.6 FITC-葡聚糖通过量的测定 细胞处理24 h后，用D-Hanks洗2遍，Transwell套筒内侧加入1 mg/mL FITC-葡聚糖，外侧加入1.5 mL平衡盐溶液，孵育4 h后，Transwell套筒内外侧分别取液体100 μL，加入到96孔板，酶标仪检测，激发波长为494 nm，发射波长为520 nm，计算FITC-葡聚糖透过量。

2.7 Rh123摄取实验 细胞分组处理后，弃上清液，每孔加入含有终浓度为5 μmol/L的Rh123，37℃避光孵育120 min，用冷HEPES溶液终止转运并漂洗细胞3遍后，加入0.2% Triton吹打细胞，细胞裂解后吸取上清液于激发波长485 nm，发射波长530 nm处检测荧光强度。并按照BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白质含量。

2.8 紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和耐药蛋白P-gp、MRP1 mRNA检测 BMEC接种于6孔培养板中，培养至80%融合，分组加药处理。各组用Trizol提取细胞总RNA，按Two-Step RT-PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA。检测ZO-1、Claudin-5、P-gp、MRP1 mRNA表达水平，以β-actin为内参，各基因进行相对定量分析。

2.9 Westernblot法检测p-Akt、Akt蛋白表达 BMEC分组加药处理后，弃掉上清液，用预冷D-Hanks洗2遍，加入RIPA裂解液，超声裂解细胞，混悬液低温离心15 min，吸取上清液，蛋白定量、变性。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗p-Akt、Akt，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜 5 min×3 次，加入辣根过氧化酶标记的二抗免疫球蛋白G（IgG），室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，增强化学发光法显影。采用ImageJ软件分析，记录灰度值，进行定量分析。

2.10 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RA对OGD/R损伤BMEC细胞活力及LDH漏出量的影响 与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞活力明显下降（P<0.001），LDH漏出量明显升高（P<0.001），RA 在 2.5、5、10 μmol/L 时能显著升高缺氧损伤 BMEC细胞活力（P<0.05，P<0.001，P<0.001），降低LDH漏出量（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。见表1。

表1 RA对OGD/R损伤BMEC细胞活力及LDH漏出量的影响（±s）Tab.1 Effect of RA on viability and LDH leakage of BMEC cells injured by OGD/R（±s）

表1 RA对OGD/R损伤BMEC细胞活力及LDH漏出量的影响（±s）Tab.1 Effect of RA on viability and LDH leakage of BMEC cells injured by OGD/R（±s）

注：与 Con组比较，###P<0.001；与 OGD/R 组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

组别Con组OGD/R组RA-L组RA-M组RA-H组动物数 6 6 6 6 6剂量（μmol/L） 细胞活力（%） LDH漏出率（%）- 99.70±1.03 101.12±1.87- 56.52±5.68### 210.05±20.02###2.5 63.33±3.98* 181.21±25.92*5 75.31±4.27*** 166.16±14.00**10 86.20±5.04*** 152.31±17.41***

3.2 RA对OGD/R损伤BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透过、Rh123摄取的影响 跨细胞间电阻值是最简单、直观的体现BBB完整性的方法。本研究所培养BMEC细胞在种于套筒内侧7 d后TEER值可达到170～180 Ω/cm2，证明细胞屏障生成，可用于后续实验。OGD/R处理后，TEER值明显降低（P<0.001），而给予5、10 μmol/L RA后可抵消ODG/R损伤造成的 TEER 降低（P<0.01，P<0.001）。见表 2。

FITC-葡聚糖透过、Rh123摄取实验，是检测BBB屏障功能的常用指标。BMEC在经过OGD/R处理后，FITC-葡聚糖通过率、胞内Rh123蓄积量明显增加（P<0.001，P<0.001），而给予 5、10 μmol/L RA 处理后能降低FITC-葡聚糖透过率（P<0.05，P<0.001），给予10 μmol/L RA能降低胞内Rh123蓄积量（P<0.01），提示RA不仅能维持内皮细胞间的紧密连接，而且能维护内皮细胞的转运功能。见表2。

表2 RA对OGD/R损伤BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透过、Rh123 摄取的影响（±s）Tab.2 Effect of RA on TEER，FITC-dextran penetration and Rh123 uptake of BMEC injured by OGD/R（±s）

表2 RA对OGD/R损伤BMEC TEER值、FITC-葡聚糖透过、Rh123 摄取的影响（±s）Tab.2 Effect of RA on TEER，FITC-dextran penetration and Rh123 uptake of BMEC injured by OGD/R（±s）

注：与 Con组比较，###P<0.001；与 OGD/R 组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

组别动物数剂量（μmol/L）透过率（%）TEER值（Ω/cm2）Con组OGD/R组RA-L组RA-M组RA-H组6 6 6 6 6 Rh123（%）- 178.32±4.88 100.01±1.41 100.88±7.89- 144.23±6.52### 170.98±13.53### 175.11±16.32###2.5 147.38±7.34 155.61±12.82 171.97±18.67 5 159.28±7.47** 149.22±11.65* 153.30±20.11 10 165.66±7.59***133.37±17.59***140.06±12.04**

3.3 RA 对 OGD/R 损伤 BMEC ZO-1、Claudin-5、P-gp和MRP1mRNA表达的影响 紧密连接是BBB通透性的中心环节，ZO-1、Claudin-5是紧密连接的主要结构蛋白，其表达水平的变化与BMEC通透性的改变程度密切相关。本实验通过Real time RTPCR法检测OGD/R损伤BMEC紧密连接ZO-1、Claudin-5 mRNA表达，结果显示，OGD/R损伤后，与Con组比较，OGD/R组 BMEC中 ZO-1、Claudin-5 mRNA 表达显著降低（P<0.001，P<0.001）；与 OGD/R组比较，5、10μmol/L RA 能显著增加 ZO-1（P<0.01，P<0.001）、Claudin-5 （P<0.001，P<0.001）mRNA 表达。见图1。

图1 RA对OGD/R损伤BMEC ZO-1、Claudin-5 mRNA表达的影响（n=6）Fig.1 Effect of RA on mRNA expression of ZO-1 and claudin-5 of BMEC injured by OGD/R（n=6）

BBB的主要功能是阻止外源和有害物质进入脑内，BBB上存在多种转运蛋白，参与物质的吸收和外排。本实验进一步检测RA对转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达的影响。结果显示，OGD/R损伤后BMEC转运蛋白P-gp、MRP1 mRNA表达显著降低，而给予5、10 μmol/L RA干预可以显著增加P-gp（P<0.05，P<0.001）、MRP1（P<0.05，P<0.01）mRNA 表达。见图2。

图2 RA对OGD/R损伤BMEC P-gp、MRP1 mRNA表达的影响（n=6）Fig.2 Effect of RA on mRNA expression of P-gp and MRP1 of BMEC injured by OGD/R（n=6）

3.4 RA对OGD/R损伤BMEC p-Akt蛋白表达的影响 血脑屏障的生物化学和构象改变可受多条信号通路调节，本研究从与中枢神经系统损伤保护机制密切相关的PI3K/Akt信号通路，考察RA对BBB的调节作用。与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞的p-Akt蛋白表达明显降低（P<0.001），给予 5、10 μmol/L RA后能不同程度的升高p-Akt表达（P<0.001，P<0.001），提示RA可能通过Akt信号通路发挥BBB的保护作用。见图3。

图3 RA对OGD/R损伤BMEC p-Ak蛋白表达的影响（n=3）Fig.3 Effect of RA on p-Ak protein expression of BMEC injured by OGD/R（n=3）

3.5RA通过PI3K/Akt通路调节OGD/R损伤BMEC BBB功能 与Con组相比，OGD/R组BMEC细胞TEER 值降低（P<0.001），FITC 透过率、胞内Rh123量增加（P<0.001，P<0.001）；与OGD/R组相比，10μmol/L RA能够显著升高TEER值（P<0.01），降低FITC透过率、胞内Rh123量（P<0.01，P<0.05）；提前给予PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002可以明显拮抗RA对BBB的上述保护作用（P<0.01，P<0.05，P<0.05）。见图4。

图4 RA通过PI3K/Akt通路调节OGD/R损伤BMEC BBB 功能（n=3）Fig.4 RA regulates BMEC BBB function induced by OGD/R through PI3K/Akt pathway（n=3）

4 讨论

BBB结构和功能的损害，使BBB通透性增加，影响脑缺血的病理生理过程，两者之间密切相关。脑缺血损伤后，快速保护并维持BBB功能，是预防继发性神经元损伤的关键[5-6]。RA广泛分布于多种植物中，尤以唇型科和紫草科植物中含量最高，具有较强的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[7-9]。目前，对RA的神经保护作用多关注于神经退行性疾病的治疗[10-11]，对脑缺血后神经系统的作用，尤其是对BBB的影响尚未见报道。查阅文献不难发现，丹参水溶性成分可以维持脑缺血后BBB稳定性，增强紧密连接蛋白表达[12]。因此，推测RA作为丹参中重要的水溶性成分，可能对BBB具有一定保护作用，其可能是丹参水溶性成分发挥BBB保护作用的物质基础之一。本研究利用原代培养大鼠BMEC细胞，建立体外BBB模型，考察RA对缺血缺氧损伤BBB功能的保护作用及机制。结果发现，RA可以显著逆转OGD/R诱导的BMEC TEER值降低，FITC-葡聚糖透过率增加，胞内Rh123蓄积，证实RA对BBB功能具有保护作用。

BBB的功能指通过其特有的紧密连接结构和多种药物外排转运体表达，以达到限制外周物质进入脑内，保持脑内环境稳态的作用[13]。跨膜蛋白，胞质附着蛋白及细胞骨架蛋白共同组成紧密连接，各种信号通路通过调控这些蛋白达到对BBB的调节[14]。ZO-1蛋白是胞质附着蛋白，将跨膜蛋白和细胞骨架蛋白连接在一起，并能识别紧密连接位置及传递各种信号，是紧密连接支持结构的基础，ZO-1缺失会导致紧密连接结构的破坏[15]。Claudins是组成紧密连接的跨膜蛋白，其种类的组成直接决定BBB的功能[16]。研究表明，在脑缺血后，BBB通透性的改变与其紧密连接蛋白Claudin-5密切关联[17]。脑缺血损伤后，脑毛细血管内皮细胞不仅紧密连接蛋白被破坏，同时转运蛋白亦受影响。转运蛋白能识别特定分子，使糖类、氨基酸类等营养物质顺利通过到达脑内，同时阻止外源和有害物质进入脑内，以维持神经系统内环境的相对稳定[18-19]。P-gp和MRP1是脑毛细血管内皮细胞膜上重要的转运蛋白，P-gp主要存在于脑毛细血管内皮的管腔侧，可将其底物从脑中外排到血液中，从而限制了这些物质向脑内的转运[20]。MRP家族主要介导多种有机阴离子的外排转运，如氧化谷胱甘肽等。研究发现，小鼠经大脑中动脉闭塞（MCAO）处理[21]，或体外内皮细胞经OGD处理后[22]，脑内皮细胞P-gp、MRP1转录水平均呈下调状态。且MRP1缺陷小鼠表现出更大的脑卒中病变，提示转录蛋白是预防中风的保护因子，具有神经保护作用[23]。本研究在评价RA对BBB通透性及转运能力的基础上，对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5和转运蛋白P-gp、MRP1的mRNA表达进行考察，进一步证实RA可以影响BBB紧密连接蛋白及转运蛋白的表达。韦立群发现，RA衍生物能有效下调MCF-7/ADM细胞中多药耐药基因的表达水平，从而降低MCF-7/ADM的耐药性诱导其凋亡[24]。这似乎与本研究结果相反，究其原因是由于实验目的并不相同，这也正体现中药对不同疾病的广泛应用。

PI3K/Akt通路是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）始动的生物信号转导通路，近来发现与中枢神经系统损伤的保护机制密切相关。研究显示，脑缺血损伤后，诱导激活PI3K/Akt信号通路，可对神经凋亡产生抑制作用，促进干细胞增殖，发挥神经保护作用[25-26]。外源性药物通过PI3K/Akt信号通路可减轻脑损伤大鼠的神经炎症和BBB破坏，改善神经功能缺损[27]。本研究结果发现，OGD/R损伤后，BMEC细胞Akt表达水平明显降低，给予RA后可以显著升高Akt表达。提前给予抑制剂LY29004，可以明显拮抗RA对BMEC细胞的通透性及转运功能，进一步证实了RA发挥BBB保护作用与PI3K/Akt信号通路相关。

基于以上结果提示，RA对缺氧/复氧诱导的体外BBB功能具有保护作用，可以影响脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白、转运蛋白表达，其机制可能与促进PI3K/Akt信号激活有关。这一结果为RA在神经保护方面的进一步研究提供了实验基础。