不同浓度明胶水凝胶用于3D生物打印的初步研究

＊贺思 黄汉记 雷丹青

(1.广西医科大学生命科学研究院 广西 530021 2.广西医科大学药学院 广西 530021)

3D生物打印技术（3D打印），该技术在矫形外科、脊柱外科、颌面外科、神经外科和心脏外科等众多学科中都有应用[1]。目前用于3D生物打印的水凝胶包括合成化合物，如聚丙烯酰胺衍生物和聚乙二醇，以及天然聚合物等[2]。水凝胶的概念在20世纪60年代初引起了生物医学领域的关注。从长期来看，水凝胶已经得到了很大的改进和提高，其在生物医学和制药方面的应用，在过去几十年里受到了特别的关注[3]。由MA改性的明胶水凝胶（Gel-MA），因其与其它现有的水凝胶形成的生物材料相比，它在一定程度上满足了生物功能和机械可调性的要求，而且通过使用3D细胞培养，不仅展示了自然的细胞外环境，而且还提供了良好的3D组织结构的可能性，所以Gel-MA受到越来越多的关注[4]。本项目研究不同浓度的可3D打印的Gel-MA，对其物理化学及生物学性能进行分析，并初步探讨其在3D生物打印中的应用价值。

1.材料和方法

(1)主要仪器与试剂

主要仪器：3D生物打印机器（pro），真空冷冻干燥机，力学测试仪（Instron5943），8mW/cm2，365nm的紫外灯（Uvitron International），电子精密天平（梅勒-托利多仪器公司），恒温培养箱（Forma）等。

主要试剂：MA改性明胶（阿拉丁生化科技），光引发剂（Irgacure2959），软骨诱导液[TGF-β1（Perotech）10ng/ml+抗坏血酸（Solarbio）50ug/ml+地塞米松（Solarbio）100nmol/ml+胰岛素-转铁蛋白-硒（Solarbio）50mg/ml]等等。

(2)不同浓度明胶水凝胶的制备

参考文献[5]所述，配制含光引发剂Irgacure2959质量浓度为0.1%的PBS溶液，称取适量的MA改性后的明胶，溶于PBS溶液中，不断搅拌，直至完全溶解，配制成一系列相同体积不同浓度的Gel-MA前体液（10%、12.5%、15%、17.5%、20%），把各浓度的Gel-MA前体液滴入直径为8mm，高为4mm的模具中，用8mW/cm2，365nm的紫外灯照射3～5min[6]，紫外光引发自由基聚合使水凝胶前体液形成水凝胶，随后放于冷冻干燥机中冷冻干燥后放于-20℃冰箱中保存。

(3)不同浓度的明胶水凝胶的表征分析

①冻干水凝胶的溶胀性能测试

参考文献[7]所述，将前述Gel-MA用电子精密天平称量并记录下原始质量W0，然后将干燥的水凝胶置于PBS溶液中，5%CO2，37℃恒温培养箱中观察水凝胶的溶胀变化并记录各个溶胀时间点2h、4h、6h、8h、10h、20h、24h取样下水凝胶的质量Wi，取样测定过程中，每次取样后，称重前用干净干燥的滤纸拭去水凝胶表面的水分，再进行称量，每组重复3个样。水凝胶的质量溶胀比计算公式为：λ（W）=（Wi-W0）/W0。

②力学检测

参考文献[8]所述，利用单抽拉伸检测法和10N负载能力的负载单元，将直径为8mm，高为4mm MA改性的不同浓度的明胶水凝胶放于载样台上，设定压缩速度为0.5mm/min后用力学测试仪检测，每组水凝胶测5个样品并重复5次。

③营养液渗透实验

参考文献[9]所述，将已经制备好的，直径为8mm，高度为4mm的不同浓度的Gel-MA，完全浸泡在5ml左右的软骨诱导液中，浸泡时间分别为15min、30min，然后再对其进行观察和拍照。

④浓度为15%的明胶水凝胶进行3D打印的初步尝试

将15%的MA改性的明胶溶液，恒温37℃下搅拌，直至溶液均一稳定。设置新型微沉积成型平台，加工温度为37℃。启动软件系统，设置相关实验参数和打印参数。将15%的明胶溶液加入料筒，进行3D生物打印。

2.结果

(1)不同浓度的明胶水凝胶的制备结果

制备出来的不同浓度的Gel-MA如图1，经过紫外光固化后的Gel-MA形态固定，呈透明态，透光性较好。在浓度为10%～20%的范围内，浓度越低，Gel-MA越透明，透光性越好。

图1

(2)不同浓度的明胶水凝胶的溶胀性能测试结果

不同浓度的Gel-MA在6小时已基本达到了溶胀平衡。浓度为10%的Gel-MA的溶胀率最高，20%的Gel-MA的溶胀率最低。在浓度范围为10%～20%的范围内，浓度越高，Gel-MA的溶胀率越低。

(3)不同浓度的明胶水凝胶的力学测试结果

不同浓度的Gel-MA的力学测试结果如图1C。10%、12.5%、15%，17.5%和20%的Gel-MA的杨氏模量分别为222.57±27.02Kpa、322.75±33.78Kpa、575.18±31.47Kpa，734.17±45.14Kpa和979.42±19.84Kpa。在浓度为10%～20%的范围内，Gel-MA浓度越大，杨氏模量越大。

(4)不同浓度的明胶水凝胶的营养液渗透实验结果

不同浓度的Gel-MA的营养渗透实验结果如图2A。从图可以看出，在浓度为10%～20%的Gel-MA中，营养液渗透较快，且Gel-MA的浓度越低，营养液渗透的越快。

图2

(5)15%浓度的MA改性明胶水凝胶的3D生物打印结果

浓度为15%的MA改性明胶水凝胶的3D生物打印结果如图2B。3D生物打印表明利用明胶水凝胶可以打印出预先设计的几何形状，且经过紫外光交联后，能够形成具有一定机械强度的水凝胶胶体。

3.讨论

3D生物打印技术作为组织工程学领域的重要技术手段之一，目前显示出很好的应用前景。打印墨水是3D生物打印技术的核心，以一种无支架的方式模拟目标组织的自然结构，能够制造出多种多样的生物材料。本研究利用不同浓度的Gel-MA，以生物打印墨水的基本参数，对其进行3D生物打印，对不同浓度的Gel-MA的溶胀性能、力学性能、营养液渗透、3D生物打印进行了研究。今后可利用不同浓度的Gel-MA作为墨水或载体，进一步研究进行负载活细胞的3D打印，用来模拟体内组织或器官的结构，构建仿生人工组织或器官，并研究其生物学特性。