百合鸡子汤通过BDNF/TrkB 介导的PI3K/Akt/mTOR 信号通路对CUMS 大鼠抗抑郁的影响

袁志鹰 李 哲林美妤李子仪陈乃宏刘 芳李 亮*

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；3.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050）

抑郁症是指以显著而持久的情绪低落、活动能力减退、思维与认知功能迟缓为主要临床特征的一类心境障碍慢性疾病,近年来发病率逐年攀升［1-3］。我国东汉医圣张仲景在《金匮要略》 中对百合病、梅核气、奔豚气等病症的论述,与现代医学对抑郁症的表述非常相似［4］。

百合鸡子汤最早记载于《金匮要略》 卷中,为治疗百合病的系列经方之一。百合鸡子汤由百合、鸡子黄组方而成,百合甘、微寒,归心、肺经,君以百合,甘凉清肺、清心安神；鸡子黄味甘性平,归心、肾、脾经,佐以鸡子黄救厥阴之阴,安胃气,胃为肺母,胃安则肺气和而令行。二味药材均为药食同源,可归属于经典的中医药膳经方,具有产品开发的重大价值。目前尚未见百合鸡子汤抗抑郁分子生物学研究报道,因此百合鸡子汤抗抑郁作用值得我们深入研究。脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 可与酪氨酸激酶受体 B(tyrosine kinase receptor B,TrkB) 结合激活BDNF/TrkB 信号传导作用,为公认的神经可塑性分子标记物［5-7］。磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR) 是BDNF/TrkB 的下游信号通路,在神经元存活、神经元再生以及突触间信息传递等发挥着重要作用［8-11］。本实验在前期对百合饮片标准化研究的基础上［12-15］,慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS) 法复制大鼠抑郁模型,并采用抑郁行为学指标结合蛋白质印迹法(Western-Blot) 技术探讨百合鸡子汤在CUMS 动物模型中抗抑郁作用及其对BDNF 和下游PI3K/Akt/mTOR 信号通路水平产生的影响,揭示百合鸡子汤抗抑郁作用机制,为百合鸡子汤的深度开发奠定基础。

1 材料

1.1 动物 SPF 级成年雄性SD 大鼠,体质量230～250 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验动物生产许可证号SCXK (湘) 2016-0002。在室温(24±1)℃、相对湿度(55±10)%、光/暗周期12 h/12 h (光照时间7:00～19:00) 的条件下饲养。大鼠自购入起适应性饲养5 d,自由获取食物和饮用水。

1.2 药物与试剂 按照处方量配比(百合、鸡子黄质量比2 ∶1),称取百合适量,加入10 倍量蒸馏水水煎提取1 h,收集水煎液,再用5 倍量水提取1 h,合并2 次水煎液,减压浓缩至1 倍体积,50 ℃下加入鸡子黄,混匀并加热10 min,即得百合鸡子汤,4 ℃保存待用。课题组前期发现,百合鸡子汤特征成分中王百合苷A 含量最高(11.05～13.76 mg/mL),而王百合苷B 含量为4.68～9.41 mg/mL,王百合苷C 含量为0.34～0.69 mg/ mL,王百合苷E 含量为0.60～0.87 mg/mL。

百合(20181201,湖南龙山和顺百合种植基地) 经湖南中医药大学中药鉴定教研室周小江教授鉴定为百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.的干燥鳞茎。氟西汀胶囊［批号B14201010566,礼来(苏州) 制药有限公司］；甲醇(批号1797207537,色谱纯,德国默克公司)；乙腈(批号AH0154HC,色谱纯,美国霍尼韦尔公司)。鼠抗大鼠BDNF (批号66292-1-Ig,美国Proteintech 公司)、兔抗大鼠TrkB (批号4603,美国Cell Signaling Technology 公司)、p-TrkB (批号4621,美国Cell Signaling Technology 公司)、PI3K (批号4292,美国Cell Signaling Technology 公司)、p-PI3K (ab182651,英国Abcam 公司)、AKT (批号4691,美国Cell Signaling Technology 公司)、p-Akt (批号4060,美国Cell Signaling Technology 公司)、mTOR (批号2983,美国Cell Signaling Technology 公司)、p-mTOR (批号5536,美国Cell Signaling Technology 公司)。RIPA 裂解液(批号P0013B,上海碧云天生物技术有限公司)；SuperECL Plus超敏发光液(批号K-12045-D50,美国advansta 公司)。

1.3 仪器 电子分析天平(ML204,瑞士Mettler-Toledo 公司)；台式超声波清洗仪(KM-250DE,昆山美美超声仪器有限公司)；循环真空水泵(SHZ-DIII,巩义市予华仪器有限公司)；台式冷冻离心机(H1650R,湖南湘仪集团)；电泳仪(DYY-6C,北京六一生物科技有限公司)；电泳槽(DYCZ-24DN,北京六一生物科技有限公司)；转膜仪(DYCZ-40D,北京六一生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分组和给药 36 只SD 大鼠按体质量随机分为6 组(CUMS 抑郁模型组、正常组、氟西汀阳性药组、百合汤低剂量组、百合汤中剂量组、百合汤高剂量组),每组6 只。给药量按照《中药药理实验方法学》 中人体和动物体表面积用药剂量换算法,阳性药组氟西汀每天1.8 mg/kg、百合鸡子汤低剂量每天2.7 g/kg、百合鸡子汤中剂量每天5.4 g/kg、百合鸡子汤高剂量每天10.8 g/kg,模型组与空白对照组用蒸馏水灌胃,每天10 mL/kg。造模灌胃同时进行,连续干预30 d。

2.2 造模 36 只SD 大鼠适应性饲养5 d 后,除空白组外单笼饲养,并接受各种应激刺激,方法包括［16-17］24 h禁食、24 h 禁水、黑白颠倒、4 ℃冰浴5 min、夹尾1 min、潮湿垫料、空笼24 h、倾笼45 度、噪音3 h,每日随机给予1～2种,同种不连续出现,使大鼠不能预料刺激的发生以避免产生适应,持续30 d。

2.3 行为学检测 采用强迫游泳实验(forced swimming test,FST)。造模结束后,向高50 cm、直径30 cm 的透明圆柱形筒中放入25 ℃清水,深度约35 cm,将大鼠放入其中,适应1 min 后记录后4 min 内大鼠游泳不动时间(以大鼠漂浮不动,仅露出鼻孔保持呼吸,四肢偶尔滑动以保持身体不至于沉下去记为不动),以大鼠的绝望行为表示其抑郁行为。

2.4 Western blot 检测

2.4.1 前额叶皮质组织样本收集及处理 行为学测试结束后,各组大鼠禁食不禁水24 h,用颈推脱臼法处死动物,通过剪刀镊子等手术器械剪开颅骨,剥离筋膜,迅速取出大脑置于PBS 缓冲液中润洗后用滤纸吸干水分,在冰上放置一个培养皿,在培养皿表面将所需要的前额叶皮质在冰上剥离,液氮速冻,-80 ℃冰箱保存待用。

2.4.2 Western blot 分析 在冻存前额叶皮质中加入组织裂解液,电动匀浆,离心,取上清液。配制4.8% 浓缩胶与10%分离胶,上样,电泳至溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。将凝胶中的蛋白分子转移到硝酸纤维素膜(NC 膜)上,封闭2 h,4 ℃过夜,用PBST 缓冲液洗涤后加入相应的一抗,室温孵育90 min,4 ℃孵育过夜,PBST 洗涤3 次后,加入稀释后的二抗与膜共同室温孵育60 min 再洗涤3次,使用ECL 化学发光液与膜孵育1 min,滤纸吸尽液体,塑封膜将膜包裹杂交膜,在暗盒内与X 胶片曝光5～120 min,显影冲洗,将曝光后的底片扫描,并用quantity one 专业灰度分析软件分析目标条带的灰度值。

2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism7.0 软件进行分析,数据以() 表示,组间比较采用单因素方差分析统计。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠强迫游泳实验 强迫游泳实验中的不动时间可以反映出受试大鼠的绝望状态,大鼠的不动时间越长表明其越绝望。如图1 所示,与正常对照组相比,模型组大鼠在强迫游泳实验中的不动时间延长(P＜0.01)；与模型组相比,氟西汀组、百合鸡子汤的低、中高剂量组大鼠在强迫游泳实验中的不动时间缩短(P＜0.01)。从大鼠强迫游泳实验中可以看出,在改善动物抑郁行为学试验方面,百合鸡子汤可改善大鼠抑郁症状,尤其是中、高剂量组效果更好。

图1 大鼠强迫游泳实验结果（n=6）

3.2 百合鸡子汤对大鼠前额叶皮质BDNF/TrkB-PI3K/Akt/mTOR 蛋白表达的影响 给予百合鸡子汤持续干预30 d 后,与正常对 照组相比,模型组 BDNF、p-TrkB/TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的蛋白表达下降(P＜0.01)；相比于模型组,CUMS +百合鸡子汤中、高剂量组的BDNF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 的蛋白表达升高(P＜0.01),氟西汀阳性药组BDNF、p-TrkB/TrkB、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 的蛋白表达升高(P＜0.05),CUMS +百合鸡子汤低剂量组亦可升高mTOR蛋白表达水平,但对于BDNF、p-mTOR/mTOR 蛋白表达水平的升高,差异无统计学意义(P＞0.05),见图2。

4 讨论

CUMS 模型已经成为一种广泛使用的啮齿类动物抑郁症模型,该模型是让大鼠或小鼠在持续时间段内(10 d～8 周) 重复暴露于各种不可预测的轻度压力下,而形成与抑郁症患者相似的行为学或病理生理学代谢物方面的改变,是国内外比较认可的抑郁模型,也是抗抑郁药物评价的主要动物模型［18］。因此本实验采用复制CUMS 抑郁大鼠模型研究百合鸡子汤,且通过动物抑郁行为学来评价CUMS 抑郁模型是否复制成功。

大鼠生性喜欢探索,前期旷场实验研究显示,CUMS组大鼠水平穿越和垂直竖立次数均明显降低。本实验中,CUMS 造模导致模型组大鼠求生欲下降,强迫游泳实验中不动时间延长,而百合鸡子汤组、氟西汀组大鼠抑郁行为得到显著改善,表明CUMS 抑郁模型复制成功,而百合鸡子汤具有较佳的抗抑郁作用。

中医药复方对人体多靶点、多环节、多层次的作用机制在抑郁症治疗方面具有较大的潜力［19］。BDNF/TrkB 以及其下游的PI3K/Akt/mTOR 的信号通路,近年来在抑郁症的发生及中药干预的作用机制研究中引起了越来越多研究人员的关注［20］。袁丽等研究百合知母汤对抑郁症大鼠行为学及海马组织中BDNF、TrkB 表达变化的影响,试验发现百合知母汤能通过BDNF/TrkB 蛋白的表达来改善抑郁症［21］。另有研究显示,甘草素 (liquiritigenin) 可以通过调节CUMS 小鼠海马BDNF/TrKB 介导PI3K/Akt/mTOR 通路发挥抗抑郁作用［22］。在本实验研究中,CUMS 降低了大鼠海马组织的BDNF、p-TrkB、p-PI3 K、p-Akt、p-mTOR 的水平,而百合鸡子汤干预能够上调这些蛋白的表达水平。这个结果表明,BDNF/TrkB 及其下游的PI3K/Akt/mTOR 信号通路可能参与了百合鸡子汤的抗抑郁作用,但是PI3K/Akt 下游信号分子环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)、FoxO3a 对百合鸡子汤的抗抑郁作用需要做进一步深入的研究。