五味子甲素对溃疡性结肠炎大鼠的保护作用
2021-03-25刘永生王金菊
刘永生 王金菊
(河南省中医院， 河南 郑州450002）
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC) 是一种常见的慢性肠道非特异性炎症,好发于左半结肠及直肠,可累及整个结肠,病变主要局限在黏膜和黏膜下层［1］,以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主要临床症状。该病给药难度大、可反复发作,病程可多达几十年甚至伴随终生,是世界卫生组织公认的难治性疾病［2］。此外,研究表明,该病可增加结肠癌的发病风险,降低了患者的生活质量［3-4］。由于该病的发病机制尚未完全明确,目前普遍认为炎症因子过度表达与免疫功能低下可能是其发病的主要原因,并与遗传、环境和微生物感染等其他因素共同作用有关,临床给药仍以水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂等化学药为主,但化学药长期使用的毒副作用较大,且患者的病情迁延不愈,导致出现较多停药现象。五味子甲素是从五味子果实中分离出来的具有生物活性的木脂素,研究表明五味子甲素具有抗炎、抗自由基［5］、保肝及抑制胃肠平滑肌痉挛［6］等作用。本研究探讨五味子甲素对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用,并且进一步探讨其作用机制,以期为进一步临床开发应用提供科学依据。
1 材料
1.1 动物 50 只SPF 级SD 大鼠,雌雄各半,体质量(200±20) g,由河南省实验动物中心提供,使用许可证号SYXK (豫) 2018-0014。大鼠给予标准颗粒饲料,自由饮用纯净水。恒温动物室的温度为(25±2)℃,相对湿度为(50±10)%,每小时通风换气8 次,光照随昼夜浮动。实验开始前所有大鼠均适应性饲养1 周。
1.2 药物与试剂 五味子甲素,批号61281-38-7,纯度为98.8%,购自南京道斯夫生物科技有限公司；美沙拉嗪(批号201803),购自牡丹江恒远药业股份有限公司,国药准字H20066027,纯度为99.3%；三硝基苯磺酸,购自美国Sigma 公司；无水乙醇,购自上海凌峰化学试剂有限公司；干扰素-6 (interleukin-6,IL-6) 和干扰素-10 (interleukin-10,IL-10) 试剂盒,购自福州迈新生物技术开发有限公司；转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1),购自北京百诺威生物科技有限公司；肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF) -α 试剂盒,购自北京欣博盛生物科技有限公司；Toll 样受体4 (toll like receptor 4,TLR4)、核转录因子(nuclear factor,NF) -κB p65、p-NFκB p65、NF-κB 抑制蛋白-α (inhibitor of NF-κB-α,IκBα)、p-IκB-α 抗体,购自美国Cell Signaling Technology 公司；RIPA 裂解液、β-肌动蛋白(β-actin) 抗体、HRP-羊抗大鼠IgG 二抗和ECL Prime 蛋白印迹试剂,购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3 仪器 T323S 型电子天平,购自德国Sartorius 公司；EXL808 全自动酶标仪,购自美国Bio-Tek 公司；MSD97K49型微量离心机,购自美国Beckman 公司；DNM-9602G 自动酶标仪,购自美国Bio-Tek 公司；蛋白电泳仪、蛋白转膜仪、化学发光扫描仪,均购自美国Bio-Rad 公司。
2 方法
2.1 造模、分组和给药 随机选取8 只SD 大鼠作为正常对照组,自由饮用纯净水；其余42 只SD 大鼠采用三硝基苯磺酸/乙醇法造模。所有大鼠禁食不禁水24 h,采用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 进行腹腔麻醉,将5%三硝基苯磺酸+50% 乙醇吸入注射器后连接一次性静脉输液针(2 mm) 并剪去针头,插入肛门上段约8 cm,以0.02 mL/kg的剂量缓慢注入5%三硝基苯磺酸+50%乙醇,轻揉大鼠腹部l min。正常对照组大鼠除了用生理盐水替代5%三硝基苯磺酸+50%乙醇溶液进行灌肠外,其他操作同造模大鼠。
造模后除正常对照组外,其他大鼠均出现腹泻、黏液脓血便、进食减少等现象,造模后第4 天随机选择2 只大鼠脱臼处死,尸检显示结肠膜出现充血、水肿并伴有溃疡形成,则提示建模成功。
将造模大鼠随机分为模型对照组、美沙拉嗪组及五味子甲素高剂量组、中剂量和低剂量组,每组均为8 只。造模后第5 天各组开始给药,五味子甲素高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠分别灌胃给予五味子甲素80、40、20 mg/kg,美沙拉嗪组大鼠灌胃给予美沙拉嗪0.4 g/kg,模型对照组和正常对照组大鼠分别灌胃给予同体积的生理盐水。各组给药时间均为2 周。
2.2 疾病活动指数的测定 实验开始时每天观察动物的体质量、腹泻和大便性状等。按照Cooper 等［7］评分标准评估各组在给药前、给药1 周和给药2 周时大鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI) 的变化,DAI=(体质量降低评分+大便形状评分+血便评分)/3。具体评分标准见表1。
表1 DAI 评分标准
2.3 血清促炎和抑炎因子水平的测定 各组大鼠于给药前、给药1 周和2 周时尾静脉取血各约0.5 mL,室温下静置30 min,待血液完全凝固后低温离心后分离得血清,采用酶联免疫吸附(ELISA) 法测定血清IL-6、IL-10、TGFβ1 和TNF-α 水平,操作时严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.4 肠道黏膜通透性实验 各组大鼠给药2 周末给药后禁食不禁水24 h,分别灌胃给予2 mL 乳果糖(lactose,L)和甘露醇(mannitol,M) 混合液(其中含5%乳果糖和2%甘露醇),将各组大鼠置于代谢笼,收集24 h 内尿液,离心,取10 mL 尿液加2 mL 硫柳汞防腐,于-70 ℃贮存待测。采用高压液相色谱分析法测定乳果糖和甘露醇水平,计算L/M 以评估各组大鼠肠道黏膜通透性。
2.5 结肠组织病理学评分 肠道黏膜通透性实验结束后各组大鼠腔注射10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 进行麻醉,麻醉后分离结肠,留取距肛门2 cm 至回盲部结肠标本,用生理盐水冲洗结肠,取1 cm 用于组织病理学检测,其余组织于-80 ℃保存待用。用磷酸盐缓冲液将结肠组织冲洗干净后置于多聚甲醛溶液(40 g/L) 固定,常规石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(HE) 染色,采用光学显微镜观察结肠组织切片,以Dieleman 的标准［8］进行组织病理学评分,正常黏膜,评分为0；基底隐窝缺损＜1/3,评分为1；基底隐窝缺损≥2/3,评分为2；隐窝缺失,仅余表面上皮,伴炎细胞浸润,评分为3；黏膜糜烂、溃疡伴大量炎细胞浸润,评分为4～5。
2.6 蛋白免疫印迹实验 取各组结肠组织适量充分研磨,加入RIPA 裂解液,冰上裂解30 min,离心(14 000×g)15 min,收集上清,二喹啉甲酸(BCA) 法测定细胞总蛋白浓度,并将浓度调整至一致。各孔取40 μg 蛋白上样,于15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(10% 分离胶和5%浓缩胶) 电泳进行蛋白分离 (电压 100 V,2～
2.5 min),采用电转法(300 mA 电流60～90 min) 将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜,5%脱脂奶粉封闭1 h。用TBST 洗膜,加入一抗孵育4 ℃反应过夜。次日先以TBST 洗膜,加入二抗孵育,室温反应1 h,再用TBST 洗膜,增强化学发光法显色,全自动凝胶成像仪采集图片。采用Image J 图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析,以TRL4、p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65 与内参β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
2.7 统计学分析 使用SPSS22.0 软件进行分析,计量数据均通过正态性检验,以() 描述；多组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验；重复观测资料则行重复测量方差分析,两两组间比较采用LSD-t检验,两两时间比较采用差值t检验。检验水准α=0.05。
3 结果
3.1 各组大鼠给药前后DAI 评分的比较 给药前除正常对照组外,其他各组大鼠DAI 评分无差异(P＞0.05),并且均较正常对照组升高(P＜0.01)。给药1 周和2 周时五味子甲素高剂量组大鼠DAI 评分较中剂量组和小剂量组降低(P＜0.05)；五味子甲素中剂量组大鼠DAI 评分较低剂量组降低(P＜0.05),模型对照组和五味子甲素低剂量组大鼠DAI 评分无差异(P＞0.05)；给药1 周和2 周时美沙拉嗪组大鼠DAI 评分较模型对照组降低(P＜0.05)。见表2。
3.2 各组大鼠给药前后血清炎症因子水平的比较 给药前除正常对照组外,其他各组大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-10和TNF-α 水平无差异(P＞0.05)；模型对照组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平较正常对照组升高,TGF-β1 和IL-10 水平较正常对照组降低(P＜0.01)。给药1 周和2 周时五味子甲素高剂量组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平较中剂量组和小剂量组降低,TGF-β1 和IL-10 水平较中剂量组和小剂量组升高(P＜0.05)；五味子甲素中剂量组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平较低剂量组降低,TGF-β1 和IL-10 水平较低剂量组升高(P＜0.05)；而模型对照组和五味子甲素低剂量组大鼠TGF-β1、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平 无差 异 (P＞0.05)。给药1 周和2 周时美沙拉嗪组大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平较模型对照组降低,TGF-β1 和IL-10 水平较模型对照组升高(P＜0.05)。见表3～4。
表2 各组大鼠给药前后DAI 评分（分，， n=8）
表2 各组大鼠给药前后DAI 评分（分，， n=8）
注:与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.05；与五味子甲素低剂量组比较,cP＜0.05；与五味子甲素中剂量组比较,dP＜0.05。
表3 各组大鼠给药前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）
表3 各组大鼠给药前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）
注:与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.05；与五味子甲素低剂量组比较,cP＜0.05；与五味子甲素中剂量组比较,dP＜0.05。
表4 各组大鼠给药前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）
表4 各组大鼠给药前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）
注:与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.05；与五味子甲素低剂量组比较,cP＜0.05；与五味子甲素中剂量组比较,dP＜0.05。
3.3 各组大鼠肠道通透性的比较 给药2 周时模型对照组大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值较正常对照组升高,甘露醇较正常对照组降低(P＜0.01)；五味子甲素高剂量组大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值均较中剂量组和小剂量组降低,甘露醇较中剂量组和小剂量组升高(P＜0.05)；五味子甲素中剂量组大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值较低剂量组降低,甘露醇较低剂量组升(P＜0.05)；模型对照组和五味子甲素低剂量组大鼠尿液中乳果糖、甘露醇、L/M 比值无差异(P＞0.05)；美沙拉嗪组大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值较模型对照组降低,甘露醇较模型对照组升高 (P＜0.05)。见表5。
表5 各组大鼠给药2 周时肠道通透性和结肠组织病理学评分（， n=8）
表5 各组大鼠给药2 周时肠道通透性和结肠组织病理学评分（， n=8）
注:与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.05；与五味子甲素低剂量组比较,cP＜0.05；与五味子甲素中剂量组比较,dP＜0.05。
3.4 各组大鼠给药2 周时结肠组织病理学评分的比较 给药2 周时模型对照组大鼠结肠病理学评分较正常对照组升(P＜0.01)；五味子甲素高剂量组大鼠结肠组织病理学评分均较中剂量组和小剂量组降低(P＜0.05)；五味子甲素中剂量组大鼠结肠组织病理学评分较低剂量组降低 (P＜0.05)；模型对照组和五味子甲素低剂量组大鼠结肠组织病理学评分无差异(P＞0.05)；美沙拉嗪组大鼠结肠组织病理学评分较模型对照组降低(P＜0.05)。见表5。
3.5 各组大鼠给药2 周时结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白 给药2 周时模型对照组大鼠结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均正常对照组升高(P＜0.01)；五味子甲素高剂量组大鼠结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均较中剂量组和低剂量组降低(P＜0.05)；五味子甲素中剂量组大鼠结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均较 低剂量组降低 (P＜0.05)；模型对照组和五味子甲素低剂量组大鼠结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白无差异(P＞0.05)；美沙拉嗪组大鼠结肠组织TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白较模型对照组降低(P＜0.05)。见表6。
表6 各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表达（， n=8）
表6 各组大鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表达（， n=8）
注:与正常对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.05；与五味子甲素低剂量组比较,cP＜0.05；与五味子甲素中剂量组比较,dP＜0.05。
4 讨论
传统中医药讲究论本而治,五味子甲素为五味子果实主要活性物质之一。已有研究［9］显示,五味子甲素对三硝基苯磺酸诱导的小鼠溃疡性结肠炎有给药作用,作用机制可能与其抑制炎症因子NO、IL-6 及TNF-α 的产生有关。
本研究采用五味子甲素对大鼠实验性结肠炎的保护作用及机制进行进一步研究,结果显示,五味子甲素给药1周和2 周时可剂量依赖性降低大鼠DAI 评分,且给药2 周时可剂量依赖性降低结肠组织病理学评分,说明五味子甲素对大鼠实验性结肠炎具有保护作用。
肠道黏膜在多种危险因素刺激下上皮屏障破坏,会导致肠组织的慢性炎症性反应而发生溃疡性结肠炎［10］。IL-6具有广泛生物活性的促炎细胞因子［11］。TGF-β 是生长因子超家族中具有免疫负调控功能的一大类细胞因子家族［12］。IL-10 维持肠道正常黏膜免疫平衡。TNF-α 参与溃疡性结肠炎的炎症反应和免疫应答。本研究结果显示,五味子甲素给药1 周和2 周时可剂量依赖性降低大鼠血清IL-6 和TNFα 水平,升高大鼠血清TGF-β1 和IL-10 水平,说明五味子甲素对大鼠实验性结肠炎的保护作用可能与其降低促炎细胞因子IL-6 和TNF-α,升高抑炎细胞因子TGF-β1 和IL-10有关。
目前研究显示,溃疡性结肠炎的发病机制可能与肠道黏膜屏障功能减弱有关［13-14］。L/M 值可间接且全面、准确地反映肠黏膜的通透性变化,L/M 值增大,说明溃疡性结肠炎肠通透性增高,肠屏障功能损害［15］。本研究结果显示,五味子甲素给药2 周时可剂量依赖性大鼠尿液中L/M比值,说明五味子甲素可降低大鼠肠道黏膜通透性,这可能是其发挥溃疡性结肠炎保护作用的机制。
NF-κB 是各种致病因子释放和表达的关键［16-17］,后续产生级联炎症反应,使炎症过程得以放大和持续,从而损伤肠黏膜,最终导致溃疡性结肠炎的发生［18］。目前已知NF-κB 的活化是溃疡性结肠炎发生发展的关键因素之一［19］。本研究结果显示,五味子甲素给药2 周时可剂量依赖性降低溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中蛋白表达水平,说明五味子甲素对大鼠溃疡组织TLR4/NF-κB 信号通路具有抑制作用,这可能是其发挥溃疡性结肠炎保护作用的机制。
五味子甲素对溃疡性结肠炎大鼠具有保护作用,可能与调控血清促炎和抑炎细胞水平,降低肠道黏膜通透性及抑制结肠组织中TLR4/NF-κB 信号通路有关。
