喀什小檗叶不同萃取部位舒张血管活性的筛选

热米莱·塔衣尔，买尔旦·玉苏甫，徐勤伟，王阿西，阿力娅·吐逊江，池峙瑾，周文婷

(新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.隶属小檗科小檗属,在新疆喀什地区野生生长,偶有种植,其果实可药食两用,具有活血、利胆、防治高血压以及抗炎等功效［1］。小檗属植物具有较高的药用价值,其根、根茎和根皮均为常见用药部位。然而近年来,对于药用植物非药用部位的研究开发受到了不少学者的关注。以往药用植物传统的药用部位被广泛应用,而非药用部位往往被废弃。研究表明,药用植物非药用部位常具有与药用部位类似的化学基础,同样具有较好的生物活性。因此,研究非药用部位,对于发展新药物、扩大药用部位、综合利用药材资源,从而加强非药用部位的应用与开发,实现中药的可持续发展有重要的意义［2-3］。目前有关喀什小檗的研究主要集中在果实,对非传统药用部位喀什小檗叶的研究报道甚少,大量叶资源未开发利用。因此,本研究拟通过采用离体血管灌流实验方法,观察喀什小檗叶是否具有舒张血管活性,并筛选有效部位,进一步对作用机制进行初步探讨,旨在为研究开发喀什小檗叶的药用价值奠定一定研究基础。

1 材料

1.1 仪器 Power Lab 生物信号处理系统(澳大利亚AD Instruments 公司)；四通道桥式放大器(澳大利亚AD Instruments 公司)；LE01046 型恒温离体组织器官灌流仪(西班牙Pan lab 公司)；RE-52AA 型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；X205BDU 型电子天平(瑞士梅特勒-仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 喀什小檗叶采集自新疆喀什地区,由新疆医科大学药学院天然药物化学与生药学教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为小檗科小檗属喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.的叶；去氧肾上腺素 (PE,阿拉丁试剂有限公司,批号H1420012)；乙酰胆碱(Ach；美国Sigma 公司,批号BCBR3 675 V)；N-硝 基-L-精氨酸甲 酯 (LNAME；美国Sigma 公司,批号WXBC6 454 V)。其余化学试剂均为国产分析纯。Kreb-Henseleit (K-H)液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L,pH 7.4)。

1.3 动物 SPF 级雄性SD 大鼠,体质量200～250 g,由新疆医科大学动物实验中心提供,动物生产许可证号SCXK (新) 2018-0003。

2 方法

2.1 喀什小檗叶不同萃取部位的制备 取喀什小檗叶0.5 kg,按照料液比1 ∶10 加入体积分数为60%的乙醇,回流提取3 次,每次2 h,过滤,合并滤液,减压浓缩,真空干燥,可得喀什小檗叶乙醇提取物浸膏,1 g 浸膏相当于3.70 g 原药材。用1 000 mL 蒸馏水溶解一部分乙醇提取物,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次至萃取完全,将所得到的各萃取液分别合并,减压浓缩,真空干燥,可得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各萃取部位用含0.2%二甲基亚砜(DMSO) 的K-H 液溶解(已有文献报道0.2% DMSO 对血管张力无影响［4］)。

2.2 大鼠离体胸主动脉环的制备［5］颈椎脱臼处死SD 大鼠,迅速打开胸腔,取出胸主动脉并置于4 ℃预冷K-H 液中(用95%O2和5%CO2混合气体预饱和),小心清除血管周围的脂肪和结缔组织后,剪成长度3 mm 左右的4 个血管环。操作过程中避免过度牵拉,以防损伤至动脉失活。去内皮血管环,用牙签轻轻地来回滚动血管环内表面去除内皮细胞来制备,未去除内皮细胞的血管环为内皮完整血管环。将血管环一端固定于具有10 mL K-H 液的浴槽中(浴槽内K-H 液温度恒温37 ℃,持续不断的通入95% O2和5% CO2混合气体),一端连于张力换能器,用Power Lab 生物信号处理系统记录血管环张力的变化。血管环起始张力在1.0 g 状态下稳定60 min,每15 min 换1 次K-H 液。用1 μmol/L PE 预收缩血管环,待血管环张力稳定后给予10 μmol/L 的Ach 舒张血管环以检查血管环内皮的完整性,舒张率达到75%以上判断为内皮完整,小于15%可认为是去内皮血管。计算公式如下。

2.3 喀什小檗叶不同萃取部位对PE 预收缩的内皮完整血管环的舒张作用 以1 μmol/L PE 预收缩各浴槽内的内皮完整血管环,采用累计给药法往各浴槽内分别加入喀什小檗叶不同萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位终浓度依次达到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次药,记录血管环张力的变化。空白组以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗叶不同萃取部位,并于给药组相同的时间记录血管环张力的变化。

2.4 喀什小檗叶不同萃取部位对PE 预收缩的去内皮血管环的舒张作用 以1 μmol/L PE 预收缩各浴槽内的去内皮血管环,采用累计给药法往各浴槽内分别加入喀什小檗叶不同萃取部位(乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位终浓度依次达到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次药,记录血管环张力的变化。空白组以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗叶不同萃取部位,并与给药组相同的时间记录血管环张力的变化。

2.5L-NAME 对喀什小檗叶乙酸乙酯部位舒张血管作用的影响 将内皮完整血管环分两组,分别为L-NAME 组和乙酸乙酯部位组。L-NAME 组用LNAME (100 μmol/L) 孵育20 min,乙酸乙酯部位组加等容K-H 液孵育20 min,然后用PE(1 μmol/L) 预收缩各组血管环,再往各组浴槽内分别逐步加入喀什小檗叶乙酸乙酯部位,使终浓度达0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次药,记录血管环张力的变化。

2.6 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理,数据以() 表示,2 组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(α=0.01)。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 血管环内皮完整性检查 Ach 可明显舒张PE预收缩的内皮完整血管环,但是对PE 预收缩的去内皮血管环几乎没有舒张作用,故本实验通过Ach(10 μmol/L) 对PE (1 μmol/L) 预收缩的内皮完整血管环(或者去内皮血管环) 的舒张率来判断血管环的内皮是否完整(或者去内皮血管环是否建立成功)。若血管环舒张率达到75%以上判断为内皮完整的血管环,可用于内皮完整实验组；若血管环舒张率小于15%可认为去内皮血管,可用于去内皮实验组。本实验中Ach 对PE 预收缩的内皮完整血管环和去内皮血管的舒张率分别为(91.25±3.12)%和(6.04±5.47)%,见图1。

图1 Ach 对PE 预收缩的内皮完整血管环（A） 和去内皮血管环（B） 的舒张作用Fig.1 Relaxation effectss of Ach on PE-pretreated endothelial-intact （A） and endothelial-free （B）aortic rings

3.2 喀什小檗叶不同萃取部位对PE 预收缩的内皮完整血管环的舒张作用 喀什小檗叶石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位对PE预收缩的内皮完整血管环的最大舒张率Emax分别为(41.59±9.08)%、(94.66±5.19)%、(50.26±14.78)%、(42.35±7.73)%。与空白组比较,只有乙酸乙酯部位可浓度依赖性的舒张PE 预收缩的内皮完整血管环,差异具有统计学意义 (P＜0.01),见图2。

3.3 喀什小檗叶不同萃取部位对PE 预收缩的去内皮血管环的舒张作用 喀什小檗叶石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位对PE 预收缩的去内皮血管环的最大舒张率Emax分别为(41.31 ± 5.37)%、(92.49 ± 6.73)%、(39.26 ±10.78)%、(45.66±7.26)%。与空白组比较,只有乙酸乙酯部位可浓度依赖性舒张PE 预收缩的去内皮血管环,差异具有统计学意义(P＜0.01),见图3。喀什小檗叶乙酸乙酯部位对PE 预收缩的内皮完整血管环和去内皮血管环均有浓度依赖性舒张作用,Emax分别为(94.66±5.19)%、(92.49±6.73)%,差异无统计学意义(P＞0.05),见图4。

图2 喀什小檗叶不同萃取部位对内皮完整血管环的舒张作用Fig.2 Relaxation effectss of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact aortic rings

图3 喀什小檗叶不同萃取部位对去内皮血管环的舒张作用Fig.3 Relaxation effects of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-free aortic rings

图4 喀什小檗叶乙酸乙酯部位对内皮完整血管环和去内皮血管环的舒张作用Fig.4 Relaxation effects of ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact and endothelial-free aortic rings

3.4L-NAME 对喀什小檗叶乙酸乙酯部位舒张血管作用的影响 喀什小檗叶乙酸乙酯部位对LNAME 组和乙酸乙酯部位组(与未经L-NAME 预处理) 的血管环均具有浓度依赖性的舒张作用,Emax分别为(96.37±10.37)%、(94.66±5.19)%,差异无统计学意义(P＞0.05),见图5。

图5 L-NAME 对喀什小檗叶乙酸乙酯部位舒张血管作用的影响Fig.5 Effects of L-NAME on vasorelaxation induced by ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves

4 讨论

高血压是严重威胁人类健康的疾病,也是导致心血管疾病患者死亡的主要危险因素。长期血压增高是导致中风、冠心病以及肾衰的危险因素之一［6］。目前已有不同种类的抗高血压药在临床广为应用,但均有一定的毒副作用,故在天然植物中寻找具有舒张血管作用的高效、低毒活性组分仍有较大的意义和研究前景［7］。液-液萃取法是根据“相似相溶” 原理对物质进行分离。由于萃取溶剂的极性不同,极性弱的成分分配到极性弱的溶剂中,极性强的成分分配到极性强的溶剂中。本实验中以喀什小檗叶为研究对象,利用液-液萃取法对喀什小檗叶醇提物进行萃取,得到不同极性的采取部位(极性强弱顺序为石油醚部位＜乙酸乙酯部位＜正丁醇部位＜水部位),再利用离体血管实验方法对不同萃取部位进行舒张血管活性筛选,结果表明喀什小檗叶乙酸乙酯部位具有显著的舒张血管作用。

血管由单层的血管内皮细胞和血管平滑肌组成［8］。血管内皮细胞作为血液和血管平滑肌之间的机械屏障,在调节血管张力、血管生成、代谢、炎性细胞黏附、血小板凝聚、血管通透性等方面起着重要的作用,其功能损伤与多种心血管疾病的发生、发展密切相关［9-10］。舒张血管作用通过内皮依赖性和非内皮依赖性等两种途径产生,内皮依赖性舒张血管作用是通过促进血管舒张因子的释放和抑制血管收缩的释放来产生,非内皮依赖性舒张血管作用是通过阻滞钙离子通道或者开放钾离子通道来产生［11］。本实验中喀什小檗叶乙酸乙酯部位对内皮完整和去内皮血管环均有浓度依赖性舒张血管作用,并且去内皮处理后,其作用强度无明显差异(P＞0.05),说明喀什小檗叶乙酸乙酯部位可能通过非内皮途径介导血管环的舒张作用。

NO 是以L-精氨酸为底物在一氧化氮合酶(eNOS) 的催化下生成的最重要的舒张血管因子。本实验中内皮完整离体血管环经一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME) 预处理后,喀什小檗叶乙酸乙酯部位对内皮完整血管环的舒张血管作用没有受到抑制,说明喀什小檗叶乙酸乙酯部位舒张血管作用与内皮源性NO 释放无关。

血管平滑肌的收缩与舒张受多种离子的共同调节,其中Ca2+浓度为至关重要,血管平滑肌细胞内Ca2+浓度升高导致血管平滑肌的收缩,细胞内Ca2+来源于从细胞外的Ca2+通过钙离子通道流入和细胞内储存钙释放［12］。血管平滑肌细胞存在电压依赖性钙通道(voltage dependent calcium channels,VDCCs) 和受体依赖性钙通道 (receptor-operated calcium channels,ROCCs)［13］。PE 是α1-肾上腺素受体激动剂,激活ROCCs,导致外钙内流,使细胞内Ca2+浓度升高,最终导致血管收缩,另外PE与α1-肾上腺素受体结合后,通过G 蛋白偶联受体激活磷脂酶C,从而产生三磷酸肌醇(IP3),IP3与肌质网膜上IP3受体结合,引发肌浆网膜储存Ca2+的释放［14］。本实验中喀什小檗叶乙酸乙酯部位对PE 预收缩血管环具有浓度依赖性的舒张作用,表明其作用机制可能与影响钙离子有关,然而对于具体的作用机制,是抑制外钙内流还是抑制内钙释放？ 本课题组还将在后续的实验中给予进一步深入研究。

小檗属植物全世界分布广泛,种类较多,喀什小檗为小檗科小檗属落叶灌木［15-16］,近年来对喀什小檗的研究多为其常见药用部位果实［17-19］,而非药用部位(如叶) 往往被废弃。因此,从喀什小檗叶中提取分离具有舒张血管作用的活性物质,不仅有利于探索具有心血管药理活性的物质基础,另外研究开发喀什小檗叶的药用价值,使之变废为宝,也有利于新疆地方特色植物资源的充分利用。