骨髓间充质干细胞在体分子影像示踪技术的研究进展

李天然（综述） 卢光明（审校）

（1.解放军总医院第四医学中心放射诊断科，北京 100048；2.解放军东部战区总医院放射诊断科，江苏 南京 21000）

基于自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）的生物治疗是多种疾病最有潜力的治疗方法[1-2]。BMSCs移植后，在体BMSCs转归的监测，即移植后BMSCs的分布、活性、分化、凋亡情况的监测，一直是干细胞研究的重要方向[3-4]。采用组织病理学观察的方法进行移植BMSCs监测需要离体进行，属于有创检测技术[5]。利用现代多模态分子影像学技术可实现对BMSCs在体、实时命运转归的示踪监测，能够无创显示BMSCs可能的演进方向[6-7]。移植BMSCs的在体影像监测包括两个方面：一是BMSCs在体迁移、分布、定位的示踪；二是在体BMSCs分化的示踪。现将有关BMSCs分子影像学示踪技术的研究进展综述如下。

1 移植 BMSCs在体迁移、分布、定位的示踪技术

对于移植BMSCs在体迁移、分布、定位的监测，从实现技术上分为光学成像、核磁共振成像（MRI）、正电子成像（PET）和单光子成像（SPECT）；从实现方式上主要分为对BMSCs进行直接标记和间接标记两种方法。

1.1 直接标记法 一种方法是利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）对BMSCs进行标记，通过MRI移植观察干细胞在肿瘤组织中的定位、迁移及分布。SPIO标记BMSCs主要有两种方法：一是将SPIO吸附于BMSCs表面，但网状内皮系统会清除SPIO标记的细胞；二是细胞将SPIO通过直接吞饮作用、受体介导胞吞作用、转染介导实现示踪剂内在化[8-9]。商品名为菲立磁的SPIO是被美国FDA批准上市的用于临床MRI成像的示踪剂。SPIO标记属于外源性铁直接标记MRI成像。有学者利用SPIO标记干细胞在体治疗软骨缺损病，在不同时间点行3.0 T MRI扫描，计算T2值作为定量指标，同时利用影像评分法观察软骨组织修复情况，结果显示，SPIO标记技术有助于利用MRI早期判断干细胞治疗大型动物模型软骨缺损是否成功[10]。SPIO具有粒径小、穿透力强、磁标时间长的特点，移植后至少在18周内可检测到磁标细胞，且弛豫率约为同样条件下钆离子（Gd3+）的7～10倍, 在很低浓度(nmol级)即可在MRI上形成对比，最主要的是，经SPIO标记后的BMSCs不改变特性，SPIO对BMSCs无毒性作用、可降解，并且改变粒径可以改变磁性[11]。甚至有研究表明，SPIO标记对干细胞的生长及其组织修复功能都有增强作用，低强度静磁场可以增强SPIO协助促进的成骨分化效应[12]。SPIO主要缩短T2时间，T2信号减低，与周围组织形成良好对比，即使低浓度也能成像[13]。SPIO磁标细胞的缺点有：①颗粒会导致信号丢失而产生“黑洞”；②铁因干细胞的增生分裂而被稀释，使得磁标记的强度下降，因而MRI测定的敏感性降低；③标记细胞死亡后可释放含铁标记物，可能会将周围未标记的细胞标记从而产生假阳性[14-15]。

直接标记移植BMSCs的另一个方法是荧光成像技术。荧光成像技术中碳量子点（carbon quantum dots，CQDs）技术在生物成像领域的应用已得到拓展。CQDs表面有丰富的羧基基团，通过偶联作用可以实现与SPIO结合，通过吞饮作用进入BMSCs内，实现稳定标记，且不改变BMSCs的理化性质，并具有通过不同波长的荧光激发实现多颜色荧光成像的优势[16-17]。

1.2 间接标记法 间接标记法主要利用BMSCs是基因良好载体这一特性，有学者指出，BMSCs是基因治疗中理想的载体细胞，在BMSCs移植前，将多种外源性目的基因整合至BMSCs基因组中，BMSCs不仅能稳定转染和表达外源性基因，而且能够定向分化，修补受损的组织[18]。对BMSCs进行基因修饰，使之携带分子影像探针基因，可以实现对其示踪。有学者对BMSCs进行跨膜蛋白-铁转运蛋白基因转染，使之高表达铁转运蛋白，该蛋白具有聚集铁离子的能力，从而产生内源性铁-MRI信号成像，实现对BMSCs的示踪，其优点在于使用内源性铁离子成像，无需外源性探针标记，且内源性铁离子表达稳定；缺点是伴随铁离子集聚会增加活性氧含量，破坏细胞结构，这成为阻碍在临床上开展成像示踪的原因，并且，随着细胞的分裂，信号会丢失[19-20]。虽然如此，间接标记法仍优于直接标记，因其更能体现BMSCs的活力状态以及提供更多的细胞功能信息。另有作者将铁蛋白重链（FTH）和转铁蛋白受体（TfR）两个报告基因同时转染BMSCs对BMSCs进行示踪，进行体外小动物MRI成像，结果显示报告基因能够为MRI成像提供足够的信号强度，能够在体内对BMSCs的迁移和分布进行MRI示踪，并且研究发现，经报告基因转染的BMSCs不影响BMSCs的生物学特性[21]，这为开展基于内源性铁MRI成像示踪开辟了新途径。还有研究者将跨膜蛋白碘化钠转运体（NIS）的基因导入BMSCs内并行正电子核素124I标记，将BMSCs细胞移植至肝癌组织中，可以通过124I-PET 监测BMSCs在肝癌组织中的活动情况，且NIS不改变BMSCs的理化性质，其另一优点是124I半衰期（半衰期4.2 d）较长，适合较长时间反复观察[22-23]。

直接标记和间接标记示踪移植干细胞都有缺点，因此，基于BMSCs是基因良好载体这一特性，构建稳定表达、不改变BMSCs生物学特性、易于标记的多模态分子影像探针，结合直接标记和间接标记的优点，解决BMSCs转归的在体、实时分子影像监测问题是现代干细胞治疗的课题之一。多模态分子影像探针解决了多分子探针重复成像的弊端，还可通过基因转染实现稳定表达和标记，适合长期反复使用。

2 移植BMSCs在体分化的示踪技术

通过以上所述的示踪技术，能够实现体内外BMSCs的迁移、分布、定位的多模态分子影像学监测。然而，在动物模型上的活体BMSCs分化示踪由于受到某些因素如成像所需分化细胞数量级别、差异性分子影像探针构建和成像设备分辨率等的限制而进展缓慢，而对BMSCs在体分化进行示踪监测更有价值和研究意义，可以实现追踪BMSCs在特定微环境下定向诱导分化的去向。因此，BMSCs分化转归的在体示踪技术受到关注。BMSCs分化示踪可以分为细胞学水平示踪和动物模型水平示踪两个层次。要完成BMSCs分化转归的示踪，必须借助分子生物学研究的最新技术。

2.1 报告基因BMSCs成像 典型的报告基因成像技术是荧光蛋白成像，荧光蛋白成像目前多限于基础生物学研究。荧光蛋白基因通过病毒和质粒等载体与目的蛋白基因整合后，可以在宿主细胞内表达并在激发光照射下发出荧光。在体小动物报告基因成像原理是，BMSCs在特定微环境诱导下的定向分化过程中，会有某些特异性生物活性因子的表达，利用其中某种特异性生物活性因子基因作为目的基因，利用该目的基因表达的特异性活性蛋白（或因子）作为启动子驱动MRI报告基因表达，可实现通过MRI报告基因成像监测BMSCs的定向分化；反之，当组织中出现某些特异性生物活性因子表达升高时可以说明BMSCs的分化状态及其特定分化方向，因此将某种特异性生物活性因子基因作为启动子基因就可以实现BMSCs特定方向分化的示踪，基于磁性物质内源性铁MRI成像成为研究的首选报告基因。有研究者通过构建神经元特异性烯醇化酶（NSE）启动子驱动FTH1基因表达的慢病毒（NSE-FTH1）载体并转染BMSCs，并将转基因BMSCs诱导分化为神经元样细胞，检测其FTH1的表达及MRI信号变化，研究NSE启动子驱动FTH1基因表达的变化并利用MRI成像监测BMSCs向神经细胞分化的可行性，结果显示，NSE启动子在BMSCs向神经细胞分化的过程中能特异性地启动报告基因FTH1表达，并且MRI信号也发生改变，作者认为基于NSE启动子报告基因内源性铁MRI成像可用于BMSCs向神经细胞分化的监测[24]。可见，通过基因转染技术实现BMSCs内源性铁MRI成像是可以实现的，但特异性高表达基因的启动子的寻找是实现BMSCs定向分化过程中分化示踪的关键。

2.2 调控表达报告基因BMSCs内源性铁MRI成像 报告基因成像技术虽然可以实现BMSCs定向分化示踪，但是这时的BMSCs分化是人为启动的、非正常BMSCs生理状态下、非自然发生的，人为干预可能改变BMSCs的生物学行为。有研究采用四环素诱导Tet-On/Tet-Off基因表达调控系统，携带自杀基因治疗间变型甲状腺癌，取得良好的效果[25]。利用这个思路，可利用四环素衍生物强力霉素作为通用诱导启动子调控跨膜蛋白如NIS或TfR、FTH目的基因的表达, 且可以有效调控基因表达的时间和水平[26-28]，即当BMSCs在特定微环境下发生定向分化时启动目的基因的表达，实现BMSCs分化示踪。因此可以进行如下设计：可以将NIS和TfR、FTH基因整合到Tet-On/Tet-Off基因表达调控系统中作为载体，基因转染BMSCs，通过强力霉素作为诱导启动子，在BMSCs开始分化的时间段内开启NIS或TfR基因的表达，并进行多模态分子影像成像，通过对成像规律的总结与分子生物学结果的互证实现对BMSCs分化的在体示踪监测。但BMSCs体外细胞学容易观察到定向分化时间，而在体动物模型或人体中难以准确观察到定向分化时间。这就需要用到筛选BMSCs定向分化最终细胞与BMSCs的分子生物标志物的差异技术。

2.3 自动调控表达报告基因BMSCs内源性铁MRI成像 采用荷肝癌鼠血清作为诱导刺激培养基，体外诱导培养BMSCs，miRNA 微阵列技术分析BMSCs表达谱的差异，筛选差异最显著的miRNA，将显著变化的miRNAs输入miRNA数据库进行下游目的基因的预测。在体动物模型根据该目的基因表达相应蛋白水平将其作为指示因子（非启动子），启动Tet-On/Tet-Off基因表达调控系统实现靶基因（如NIS和TfR、FTH）表达[29]，进行在体分子影像学BMSCs示踪成像。更进一步设计，并在此基础上，探索设计特异性启动子（specific promoter），当目的基因表达出现差异时，该特异性启动子启动靶基因（如NIS或TfR、FTH）的表达，进行MRI分子影像学成像，观察成像规律，实现在体BMSCs定向分化的在体示踪。

虽然通过这种设计，理论上可以实现BMSCs的分化的自动示踪，但也存在诸多问题，比如BMSCs内转染多种生物活性因子后，对BMSCs的定向分化是否会有影响？对干细胞的生物活性是否存在影响？由此可见，实现BMSCs的在体分化示踪需要多种生物技术进行合力攻关。

目前，BMSCs迁移、分布、定位的在体示踪技术通过合适的标记技术基本可以实现，尤其是通过基因修饰实现多模态分子影像成像成为可能。相比较而言，BMSCs分化的在体多模态分子影像示踪技术实现较为困难，主要与靶分子的标记、分化后的降解、设备的分辨率有关，但通过多种生物学技术的合理应用将有望实现BMSCs在体分化的多模态分子影像示踪。设计简单易行、特异性强、灵敏度高、细胞毒性低、受外界干扰小以及移植干细胞的长期定量等优点的内、外源分子影像探针是科研攻关的目标。