加味五虎追风散通过调控TFEB 介导的自噬干预帕金森病发病的实验研究

张兴博,梁健芬,陈 炜,徐柳炎,蒙健林

帕金森病(Parkinson"s disease,PD)是临床常见的神经系统退行性疾病,同时也是中老年人致残的主要原因之一,其病理变化主要为黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性缺失。在PD 发病过程中,大量的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)异常折叠和聚集依旧是PD 发病的中心事件[1],而激活自噬可加速α-syn 的降解进而参与PD 的发病[2],同时,PD 多巴胺能神经元自噬又受到转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)的调控,现已证实,在PD 细胞自噬过程中TFEB是多巴胺能神经元自噬调节的关键信号分子,其可通过调控自噬,阻断异构α-syn 蛋白聚集[3],进而阻止多巴胺能神经元死亡。本研究以鱼藤酮诱导的PD 大鼠作为研究对象,在中医理论的指导下,给予加味五虎追风散治疗,观察其对PD 大鼠黑质TFEB、微管相关膜蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)Ⅱ、泛素结合蛋白P62(P62)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)蛋白表达的影响及对α-syn 的清除作用,以探讨加味五虎追风散治疗PD 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠60 只,雄性,体重200～250 g,实验动物由广西医科大学动物实验中心提供(动物合格证号SCXK 桂2009-0002)。所有大鼠在通风良好的条件下分笼饲养,自由摄食及饮水。

1.2 药物、试剂与仪器 加味五虎追风散方药组成:蝉蜕6 g,天南星6 g,天麻12 g,全蝎3 g,僵蚕10 g,大地棕根15 g。使用中药配方颗粒剂,由江阴天江药业有限公司提供,产品批号:1401018。鱼藤酮、葵花乳油均购自Sigma 公司;兔多克隆α-syn 抗体、兔多克隆LC3 抗体、兔源P62 多克隆抗体均购自英国Abcam 公司;鼠抗酪氨酸羟化酶抗体购自北京碧云天生物有限公司;Actin 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;其他试剂均为市售、分析纯化。

1.3 模型制备及给药方法 将大鼠适应环境饲养、行为学训练(大鼠爬杆实验和转棒耐力)1 周,将60 只大鼠随机分为正常组、模型组、中药组,各20 只。模型组、中药组大鼠采用鱼藤酮颈背部皮下注射构建PD大鼠模型,配制鱼藤酮葵花油乳化液,浓度为2 mg/mL,造模剂量为2 mg/kg,每日按时颈部、背部交替皮下注射。正常组注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化剂,给药4 周,造模结束后参照陈忻等[4]的行为学评分标准,行为学评分在2～8 分的大鼠视为造模成功,最终模型组及中药组各造模成功16 只,正常组死亡4 只。中药组给予加味五虎追风散灌胃,给药量为生药608.4 mg/kg,按照该给药剂量,将加味五虎追风散配制成16.30 mg/mL,现配现用,灌胃液体量为2 mL/100 g,每日2 次,间隔12 h。正常组及模型组给予等量无菌蒸馏水代替灌胃。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 免疫组织化学染色法测定黑质TH 阳性细胞数目 大鼠断头取脑,4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h,然后磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗30 min×3 次,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,快速冷冻切片,切片厚30μm,切片脱蜡,以0.01 mmol/L PBS 冲洗,用磷酸缓冲液配制的4% 多聚甲醛固定,然后按SABC(strept avidin-biotin complex)法进行免疫组化染色,以H2O2作用30 min,山羊血清封闭1 h,加兔抗、TH抗体(1∶10 000)分别室温孵育1 h,4 ℃过夜,次日37℃孵育1 h;加入生物素标记的IgG 二抗室温孵育2 h;加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色。取黑质致密部条带区相同部位相邻切片3 张,400 倍镜下观察计数双侧黑质致密部条带区TH 阳性细胞数量。

1.4.2 免疫印迹(Western Blot)法检测TFEB、LC3Ⅱ、P62、α-syn、TH 蛋白表达 鱼藤酮注射4 周后,将3 组大鼠断头取脑,分离出中脑黑质组织,蛋白裂解后采用Western Blot 检测TFEB、LC3Ⅱ、P62、α-syn、TH 蛋白表达。主要步骤:取材后将黑质组织按照质量体积比为1∶10 比例加入裂解液,冰上超声处理10 s 后,沸水浴中5 min 变性,15 000 r/min 离心15 min,吸取上清液,每管20μL 分装,-70 ℃保存。取10 μL 样品,泳道上样于12%聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)进行凝胶电泳,4 ℃300 mA 电转90 min。5%BSA-TBST 封闭1 h 后,加入相应蛋白抗体,4 ℃过夜。TBST 缓冲液漂洗10 min×3 次后,加入二抗,室温孵育1 h 后加入ECL 实时荧光定量试剂盒发光底物显色。化学发光凝胶成像系统显影分析。用目的蛋白灰度值与胞浆蛋白内参β-actin 灰度值之比计算蛋白的相对表达度。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,两样本均数比较采用t检验,若方差不齐采用方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3 组大鼠行为学比较 模型组出现拘捕行为,主动活动明显减少、动作迟钝缓慢,并伴有震颤及步态不稳,部分出现向单侧进行斜卧;中药组上述表现较模型组减轻。模型组行为学评分明显高于正常组,中药组行为学评分较模型组明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.01)。详见表1。

表1 3 组大鼠行为学评分比较(±s) 单位:分

表1 3 组大鼠行为学评分比较(±s) 单位:分

与正常组比较,①P ＜0.01;与模型组比较,②P ＜0.01。

组别 只数 行为学评分正常组 16 0模型组 16 5.33±1.13①中药组 16 2.67±0.98①②

2.2 3 组大鼠中脑黑质TH 神经元数目比较 模型组大鼠黑质内TH 神经元数目较正常组明显减少,与模型组比较,中药组TH 神经元数目明显增多,差异均有统计学意义(P＜0.01)。说明加味五虎追风散在一定程度上可以抑制PD 大鼠多巴胺能神经元损伤。详见表2。

表2 3 组中脑黑质TH 神经元数目比较( ±s) 单位:个

表2 3 组中脑黑质TH 神经元数目比较( ±s) 单位:个

与正常组比较,①P ＜0.01;与模型组比较,②P ＜0.01。

组别 只数 TH 阳性神经元数目正常组 16 64.2±6.8模型组 16 27.4±5.7①中药组 16 36.2±4.9①②

2.3 3 组大鼠脑内黑质TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn表达比较 与正常组比较,模型组黑质内LC3Ⅱ、P62、α-syn 蛋白表达明显增高(P＜0.05 或P＜0.01),TH表达明显降低(P＜0.01);与模型组比较,中药组TFEB、LC3Ⅱ及TH 表达水平明显增加(P＜0.05 或P＜0.01),P62、α-syn 表达减少(P＜0.01)。说明加味五虎追风散可增加TFEB 因子、自噬蛋白LC3Ⅱ及TH 的表达,进而减少P62、α-syn 的聚集。详见表3。

表3 3 组脑内黑质TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn 表达比较(±s)

表3 3 组脑内黑质TFEB、LC3Ⅱ、P62、TH 及α-syn 表达比较(±s)

与正常组比较,①P ＜0.05,②P ＜0.01;与模型组比较,③P ＜0.05,④P ＜0.01。

组别 只数 LC3Ⅱ P62 TFEB α-syn TH正常组 16 1.17±0.33 0.96±0.19 0.77±0.10 0.63±0.03 1.23±0.15模型组 16 1.69±0.54② 1.34±0.47① 0.70±0.12 1.33±0.05② 0.67±0.09②中药组 16 2.06±0.37②③ 0.56±0.16②③ 0.86±0.08②④ 1.08±0.04②④ 0.98±0.11②④

3 讨 论

PD 属中医学“颤证”范畴,病位在脑,证属本虚标实,肾虚为本病发病之根本,标实为痰瘀交阻生风而致心神失主,经脉肢体失控[5-6]。有文献报道,加味五虎追风散对保护多巴胺能神经元功能有一定作用,但其具体机制尚未明确[7-8]。本研究采用加味五虎追风散干预PD 模型大鼠,补肾生髓、化痰祛瘀、息风,正切合PD 病机。

目前研究发现,PD 的发病与多种机制相关,但多巴胺神经元中出现路易小体并导致多巴胺神经元损伤是PD 的病理特征[9],而α-syn 的折叠异常与聚集是产生过氧化脂质的主要原因,目前研究发现细胞自噬功能障碍导致α-syn 清除障碍在PD 发病中有重要作用,LC3Ⅱ及P62 均与细胞自噬密切相关,LC3Ⅱ作为细胞中自噬体的标志物之一,在自噬体形成各阶段的内外膜上均可以检测到LC3Ⅱ,其含量与自噬泡的数量成正比,可反映自噬活性的高低;P62 是选择性自噬的底物蛋白,其在LC3 和泛素化底物之间起连接作用,可以将LC3 和相应的泛素化底物整合到自噬体中,最终在自噬溶酶体中降解。因此,P62 为判断自噬降解的一个指标,以通过检测P62 蛋白的表达量来观测自噬流,随着自噬过程的加强,P62 表达量通常下调[10]。

TFEB 是调控自噬-溶酶体系统的主要调控因子,可作为调节剂参与溶酶体合成和表达,调控细胞自噬,是调控细胞自噬的转录因子,当细胞中的平衡被外界打乱时,就会通过溶酶体来触发转录因子,从而纠正外来的干扰[11],在过表达α-syn 的PD 动物模型中,TFEB 功能受损可增加α-syn 对多巴胺能神经元的毒性,TFEB 过表达则可增强细胞自噬功能,促进α-syn清除[12]。

环境毒素鱼藤酮引起的LC3Ⅱ表达量增高并非由于自噬激活,而是自噬流受阻导致自噬体降解障碍产生堆积。本研究发现,鱼藤酮颈背部皮下注射诱导的PD 大鼠模型中,模型组大鼠黑质纹状体有大量α-syn聚集,同时发现模型组大鼠LC3Ⅱ、P62 增加,TH 减少,说明鱼藤酮有抑制自噬流的作用,可能抑制自噬体的降解引起自噬体堆积,经加味五虎追风散干预后可见TFEB、LC3Ⅱ明显增加,P62 及α-syn 明显降低,说明PD 大鼠纹状体神经细胞自噬活性降低与α-syn 沉积有关。已有研究证明,α-syn 的异常聚集导致TH 活性下降,表达减少,进一步导致多巴胺变性死亡[13]。本实验表明,自噬蛋白LC3Ⅱ表达增加,P62 表达减少后α-syn 表达随之减少,反之LC3Ⅱ表达减少,P62 表达增加后α-syn 表达增加,TH 减少,多巴胺神经元死亡;而加味五虎追风散可通过调节TFEB、LC3Ⅱ及P62 的表达进一步减少α-syn 的聚集,从而发挥多巴胺能神经元的保护作用。

综上所述,加味五虎追风散可保护鱼藤酮所致的多巴胺能神经元损伤,激活细胞自噬功能,而通过TFEB、LC3-Ⅱ及P62 促进α-syn 的自噬性清除可能是作用机制之一。这为PD 的病因治疗提供了新的思路,同时为中医药治疗PD 提供了理论依据。