奥美拉唑治疗对反流性食管炎模型大鼠食管菌群构成的影响

高 峰，贾梦真，孙 玥

(1.首都医科大学附属北京安贞医院 消化内科，北京 100029;2.北京市顺义区医院 消化内科，北京 101300)

反流性食管炎(reflux esophagitis)是胃、十二指肠内容物反流入食管引起的食管炎性病变[1-2]。新的研究发现，反流可以导致食管菌群构成改变，并且食管菌群构成改变在反流性食管炎的发生及疾病发展中起重要作用[3-4]。质子泵抑制剂(proton pump inhibitors，PPI),如奥美拉唑(omeprazole)是反流性食管炎治疗的常用药物[5-6]，长期使用PPI会改变肠道菌群构成[7]，但PPI对食管菌群构成的影响却研究较少[8-9]。本研究旨在初步探讨大鼠反流性食管炎动物模型食管菌群构成的变化，以及PPI治疗对食管菌群构成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:健康清洁级雄性SD大鼠18只，体质量(300±20)g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，每日自由进食标准颗粒维持饲料及蒸馏水。实验过程遵守动物伦理与福利的相关规定，SD大鼠安置在50%±5%湿度、(23±2)℃和12 h∶12 h光/暗循环的动物实验室中。

1.1.2 药物:奥美拉唑(omeprazole)肠溶片(山东新时代药业有限公司，国药准字H20044871，10 mg/片)，根据大鼠与成人用药剂量换算公式折算为4 mg/(kg·d)灌胃[10]。

1.2 方法

1.2.1 分组:SD大鼠用随机数表法分为假手术对照组(灌蒸馏水)、反流性食管炎对照组(灌蒸馏水)和PPI治疗组(灌奥美拉唑)，每组6只。

1.2.2 动物模型建立:采用幽门部分结扎及前胃完全结扎手术建立大鼠反流性食管炎模型(图1)[11]。假手术对照组：术前24 h禁食不禁水，麻醉后开腹翻动胃2-3次，予无菌0.9%氯化钠溶液冲洗腹腔并用无菌纱布吸尽腹腔中的液体，然后关闭腹腔，术后48 h禁食不禁水。

A.the abdomen was opened by making a 3-to 4-cm-long midline incision;B.exposure of the stomach;C.insertion of the stent (outside diameter 3.7 mm) into the pyloric ring,ligation of the pyloric ring with 2-0 silk thread,and fixation of the thread into the muscular layer with 5-0 silk thread;D.ligation of the transitional line between the fundus and the glandular portion of the stomach with 2-0 silk thread;E.suture of the gastric incision;F.closure of the abdomen图1 幽门部分结扎及前胃完全结扎法建立反流性食管炎模型步骤Fig 1 Steps to establish reflux esophagitis rat model by partial pylorus ligation and complete forestomach ligation

1.2.3 给药:造模1周后，PPI治疗组每日灌服奥美拉唑肠溶片蒸馏水溶液4 mg/(kg·d)，每日1次，共2周；假手术对照组和反流性食管炎对照组每日给予对应容量蒸馏水灌胃。

1.2.4 术后观察及标本收集:末次灌服蒸馏水/奥美拉唑肠溶片后，禁食不禁水24 h，腹腔注射0.9%氯化钠溶液配制的1%戊巴比妥钠溶液，按40 mg/kg剂量麻醉。打开腹腔及胸腔，将大鼠食管从咽部至贲门整段取出，纵行剖开食管，肉眼观察食管下段黏膜表面有无糜烂及溃疡。于食管下段黏膜齿状线上 0～1 cm处取组织标本2块，其中1块置入装有RNA酶的无菌冻存管内-80 ℃保存，用于菌群检测，另1 块置入10%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色和反流性食管炎病理分级。病理分级参考2003年中华医学会消化内镜分会颁布的《反流性食管炎诊断及治疗指南》中的轻度、中度和重度标准[12]。

1.2.5 食管菌群构成分析:食管菌群 DNA 分离、提取、纯化、扩增及测序参考相关文献完成[13]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠术后体质量变化

术后第3天起假手术对照组大鼠体质量明显高于反流性食管炎对照组和PPI治疗组(P<0.05)，术后第13天起PPI治疗组大鼠体质量明显高于反流性食管炎对照组(P<0.05)(图2)。

2.2 食管菌群构成结果

假手术对照组、反流性食管炎对照组和PPI治疗组操作分类单元值(operational taxonomic units,OTU)分别为515.1±23.5、471.8±49.7和522.0±28.9，其中反流性食管炎对照组和PPI治疗组间存在明显差别(P<0.05)；香农指数(Shannon index)分别为5.0±0.1、4.4±0.5和4.7±0.6，其中假手术对照组和反流性食管炎对照组间存在明显差别(P<0.05)。假手术对照组、反流性食管炎对照组和PPI治疗组的放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)丰度值之和占99%，且各组间丰度值无明显差异。

Compared to the reflux esophagitis control and PPI (omeprazole) treatment groups,the body weight of sham operation group was significantly higher from days 3 after the operation (P<0.05);the body weight of the PPI omeprazole treatment group was significantly higher than that of the reflux esophagitis control group from days 13 after the operation(P<0.05);*P<0.05 compared with reflux esophagitis control and PPI treatment groups;#P<0.05 compared with reflux esophagitis control group图2 各组大鼠造模术后体质量变化趋势Fig 2 Changes in body weight after the operation of reflux esophagitis in rat

在纲水平：丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)在假手术对照组、反流性食管炎对照组和PPI治疗组中的丰度值分别为1.6%±0.2%、0.9%±0.5%和1.3%±0.3%(P<0.05)；梭菌纲(Clostridia)在这三组中的丰度值分别为10.7%±1.2%、7.8%±3.3%和9.0%±1.8%；ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)在这3组中的丰度值分别为1.6%±0.1%、1.1%±0.5%和1.2%±0.2%；其中假手术对照组和反流性食管炎对照组间丹毒丝菌纲、梭菌纲和ε-变形菌纲丰度值存在明显差别(P<0.05)(表1)。

在属水平：消化链球菌属(Peptoclostridium)在假手术对照组、反流性食管炎对照组和PPI治疗组中的丰度值分别为2.5%±0.5%、1.7%±0.7%和1.9%±0.5%；螺杆菌属(Helicobacter)在这3组中的丰度值分别为1.5%±0.1%、1.0%±0.5%和1.2%±0.3%；苏黎世杆菌属(Turicibacter)在这3组中的丰度值分别为1.0%±0.2%、0.5%±0.2%和1.0%±0.4%(P<0.05)；其中假手术对照组和反流性食管炎对照组间消化链球菌属、螺杆菌属和苏黎世杆菌属丰度值存在明显差别(P<0.05)(表1)。

表1 各组食管黏膜门、纲、属水平菌群构成结果比较Table 1 Composition of esophageal mucosal microbiota at the levels of phylum,class and genus

2.3 反流性食管炎病理分级

反流性食管炎对照组和PPI治疗组病理分级轻度、中度和重度分别为0/4/2例和5/1/0例(P<0.05)。

3 讨论

胃食管反流物可以破坏食管黏膜屏障，使食管上皮细胞直接接触食管内细菌，导致食管菌群构成发生改变。食管菌群构成改变可引起慢性黏膜炎性反应和疾病发生[14-15]。目前PPI是反流性食管炎治疗的常用药物，但有研究发现仍有19%患者在经过6个月PPI规范治疗后食管黏膜不能完全愈合[6,16]，且长期使用PPI会改变肠道菌群构成[7]。本课题组先前的研究发现中国反流性食管炎患者食管菌群构成较健康志愿者确实发生了改变，在属水平螺杆菌属丰度值降低[17]；PPI治疗后，食管黏膜愈合组食管下段黏膜中的乳杆菌科、乳杆菌属、双歧杆菌属、螺杆菌属丰度值均明显高于治疗前，而愈合不良组治疗前与治疗后食管菌群构成无明显变化[9]。食管菌群受生活及饮食习惯的影响，临床患者的入选要严格排除这些影响因素，而反流性食管炎实验动物模型可以排除这些因素的影响。

本研究发现反流性食管炎对照组操作分类单元值(operational taxonomic unit,OTU)较假手术对照组有降低趋势，而PPI治疗组OTU有升高趋势，且较反流性食管炎对照组明显增加。香农指数也体现为反流性食管炎对照组降低。反流性食管炎患者食管黏膜OTU和香农指数较健康志愿者降低相一致[17]，说明反流性食管炎大鼠未予治疗组食管菌群多样性降低，而PPI治疗组可恢复反流性食管炎大鼠食管菌群多样性。

本研究还发现在反流性食管炎对照组中螺杆菌属丰度值明显低于假手术对照组，而PPI治疗组与假手术对照组间没有明显差别。螺杆菌属丰度值的差别与临床研究结果相一致[9,17]。有研究认为幽门螺杆菌感染可以激活胃底和贲门的迷走神经受体，分泌血清胃泌素，增加食管下括约肌压力；减少胃酸和胃内容物的反流，保护食管黏膜[18]。本研究结果提示食管螺杆菌属中的某些菌种可能会起到抑制反流、保护食管黏膜的作用，但具体是哪种食管螺杆菌种起作用尚需进一步研究。

有研究在溃疡性结肠炎患者中发现，消化链球菌属对肠道黏膜起保护作用，其丰度值减少会加重溃疡性结肠炎的进展[19]。本研究发现反流性食管炎对照组消化链球菌属丰度值较假手术对照组降低，而PPI治疗组与假手术对照组间差别无统计学意义，说明PPI可能通过增加有益菌消化链球菌属丰度值从而起到治疗作用。反流性食管炎对照组中苏黎世杆菌属丰度值明显低于假手术对照组，而PPI治疗组与假手术对照组间差别无统计学意义。在右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型中，苏黎世杆菌属丰度值与右旋糖酐硫酸钠诱导处理密切相关[20]，在大鼠长期使用PPI肠道菌群苏黎世杆菌属丰度值会增加[21]。因此苏黎世杆菌属在食管可能起到有益作用，经过PPI治疗食管黏膜其丰度值会恢复正常状态。

综上所述，反流性食管炎大鼠食管菌群构成发生改变，有益菌减少；灌服质子泵抑制剂奥美拉唑治疗后，食管黏膜损伤减轻，有益菌比例增加，食管菌群构成恢复正常状态，这可能为从食管菌群变化角度评价反流性食管炎的发生及疾病发展提供新的方向。