决明子蒽醌苷对非酒精性脂肪肝病大鼠脂酸β 氧化相关酶蛋白表达的影响*

李玉晶，侯 伟，陈文慧，龙雨霏，武俊紫△

1 昆明卫生职业学院病理学与病理生理学教研室，云南 昆明 650600；2 云南中医药大学基础医学院

近年来随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发生率逐年升高［1］。有研究［2-4］显示，我国不同地域、不同饮食的人群NAFLD 的患病率一致，约占总人数的12%～24%。目前对于本病的治疗尚无特效药，因此开发新的治疗药物十分必要。决明子蒽醌苷为我国药食同源目录中决明子的主要药理成分，有抗脂质过氧化、降脂、清除自由基及维持细胞膜稳定等作用［5］。其对脂肪肝病的治疗虽有文献［6］报道，但是有关作用机理的研究相对较少，本研究通过脂酸β氧化核心蛋白过氧化物酶酰基辅酶A 氧化酶1（peroxidase acyl coenzyme a oxidase 1，ACOX1）和肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmi toyl transferase 1A，CPT1A）探讨决明子蒽醌苷对NAFLD 的治疗作用及其机理，为决明子蒽醌苷的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级 SD 大鼠 60 只，雄性，体质量160～180 g，购自昆明医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK（滇）2015-0002。动物购买后均饲养于SPF 级动物房，每日明暗12 h 交替，温度22～28℃，湿度40%～60%，自由饮食。

1.2 药品与试剂93.6%的决明子蒽醌苷［7］（陕西元朗生物工程有限公司）。谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT，批号：29872201）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST，批号：29113801）、甘油三酯（triglyceride，TG，批号：33122201）和胆固醇（total cholesterol，TC，批号：34078601）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒（批号：MD115）和BCA 蛋白定量试剂盒（批号：MD912022）购自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜、ACOX1（批号：SC-517306）、肉毒碱棕榈酰转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A，批号：SC-393070）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，批号：SC-365062）抗体均购自美国Santa公司；二抗（北京中杉金桥生物科技公司，批号：ZF-0311）；戊巴比妥（江苏艾康生物医药研发有限公司，批号：76-74-4）；增强型ECL 发光试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；胶片（中国乐凯集团有限公司）；引物由上海英俊公司设计并生产。

1.3 实验仪器电子天平（常州万泰天平仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海喆图仪器有限公司）；-86℃冰箱（美的公司）；普通冰箱（海尔公司）；分光光度计（上海美析仪器公司）；酶标仪和高速冷冻离心机（赛伯乐仪器有限公司）；蛋白电泳仪（美国伯乐公司）；GelTower 简约型凝胶成像仪（德国耶拿分析仪器股份公司）；RT-qRCR 仪（罗氏诊断产品有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模、治疗和处理 适应性喂养10 天后，按照随机数字表法将大鼠随机分为6组，即正常组（普通饲料喂养8 周+1 mL/（kg·d）生理盐水灌胃8 周）、模型组［高脂高糖饲料喂养8周+1 mL/（kg·d）生理盐水灌胃8 周］、阳性药物组［高脂高糖饲料喂养8 周+23 mg/（kg·d）多烯磷脂酰胆碱灌胃8 周］、决明子蒽醌苷低剂量组［高脂高糖饲料喂养8 周+5 mg/（kg·d）决明子蒽醌苷灌胃8 周］、中剂量组［高脂高糖饲料喂养8 周+10 mg/（kg·d）决明子蒽醌苷灌胃8周］和高剂量组［高脂高糖饲料喂养8 周+20 mg/（kg·d）决明子蒽醌苷灌胃8周］。结束后全部大鼠分批次禁食12 h过夜，于次日采用3%的戊巴比妥（0.2 mL/kg）腹腔注射麻醉，心脏取血，最后取出肝脏组织行病理学检测（取肝左叶约1/4 置于4%的中性福尔马林溶液中保存，其余置于超低温冰箱中保存）。

1.4.2 血清 ALT、AST 及 TG、TC 测定 血液收集后，冰水中放置10 min，后采用低温高速离心机离心半径 5 cm，3000 r/min 离心 10 min，收集血清，按照试剂盒说明测定血清ALT、AST、TG及TC水平。

1.4.3 组织病理学检测 从4%的中性福尔马林溶液中取出肝脏组织，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下观察，计算机彩色成相系统照相。

1.4.4 ACOX1 和CPT1A 蛋白观察 采用免疫印迹法（Western Blotting）检测肝脏组织中ACOX1和CPT1A 蛋白表达。精确称取肝脏组织100 mg，加入1 mL 的总蛋白提取液，匀浆后离心半径5 cm，4000 r/mim 离心15 mim，离心后收集上清，定量调平后，每组各取60 μg行SDS-PAGE 电泳，完成后半干转移法将目标蛋白转移至PVDF膜，取出PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h，PBST洗涤3次后加入一抗过夜，次日PBST再次洗涤3 次后加入二抗，1 h 后PBST洗涤3次，暗室曝光洗片，收集图像，采用Image J 计算各条带灰度值，结果以所测蛋白的灰度值与GAPDH灰度值的比值表示。

1.4.5 ACOX1 和 CPT1A 的 mRNA 检测 每组各取30 mg 肝脏组织，用天根总RNA 提取试剂盒提取总RNA，提取后定量调平，按照试剂盒说明书各逆转录cDNA，完成后以cDNA 为模板，进行实时荧光定量 PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）检测，反应条件95℃预变性2 min；95℃变性10 s、退火：60℃30 s、72℃延伸 35 s，循环次数 34 次，最后72℃条件下再延伸5 min。计算方法为2-ΔΔCT。以各基因所测值与正常组的比值作为该基因的相对表达量。

CPT1A 引 物 设 计 ，上游 ：5′-ATGACGGCTATGGTGTCTCC-3′，下游：5′-GTGAGGCCAAACAAGGTGAT-3′；ACOX1引物设计为，上游：5′-CTTGTTCGCGCAAGTGAGG-3′，下游：5′-CAGGATCCGACTGTTTACC-3′；GAPDH 引物设计为，上游：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.5 统计学方法采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能与正常组比较，模型组大鼠AST 和ALT 升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组和决明子蒽醌苷3 个剂量组AST 和ALT 均降低（P＜0.05），决明子蒽醌苷高剂量组低于阳性药物组（P＜0.05），见表1。

2.2 血脂与正常组相比，模型组大鼠血清中TG和TC升高（P＜0.05），与模型组比较，阳性药物组和决明子蒽醌苷3 个剂量组TG 和TC 均降低（P＜0.05），决明子蒽醌苷高剂量组低于阳性药物组（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠AST和ALT比较（） U/L

表1 各组大鼠AST和ALT比较（） U/L

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与阳性药物组比较，P＜0.05

ALT 30.56±5.13 56.78±8.98 41.29±7.24*#45.66±7.76*#42.39±6.97*#36.75±5.83*#△组别正常组模型组阳性药物组决明子蒽醌苷低剂量组决明子蒽醌苷中剂量组决明子蒽醌苷高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 AST 44.67±6.54 76.35±9.63 53.92±7.08*#60.32±7.74*#55.94±6.58*#48.90±5.97*#△

表2 各组大鼠TG和TC比较（） mmol/g

表2 各组大鼠TG和TC比较（） mmol/g

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与阳性药物组比较，P＜0.05

TC 1.12±0.13 3.34±0.23*2.42±0.34*#2.70±0.29*#2.41±0.27*#2.10±0.32*#△组别正常组模型组阳性药物组决明子蒽醌苷低剂量组决明子蒽醌苷中剂量组决明子蒽醌苷高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 TG 0.12±0.04 0.82±0.12*0.59±0.09*#0.67±0.08*#0.61±0.13*#0.50±0.07*#△

2.3 HE 染色正常组大鼠肝细胞核分布均匀，大小均已，无脂肪空泡；模型组出现明显的脂肪空泡，细胞核大小不一致，且呈明显的炎症反应；决明子蒽醌苷3 个剂量组脂肪颗粒数量均呈不同程度减少，炎症反应减轻，高剂量组几乎看不到任何脂肪空泡；阳性药物组和高剂量基本一致，几乎看不到任何脂肪空泡。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织（HE，×400）

2.4 大鼠ACOX1和CPT1A蛋白表达与正常组相比，模型组、阳性药物组和决明子蒽醌苷3 个剂量组大鼠肝脏组织中ACOX1 和CPT1A 蛋白表达均降低（P＜0.05），决明子蒽醌苷低剂量和中剂量组以及阳性药物组基本一致，高剂量组高于阳性药物组（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组大鼠肝脏组织中ACOX1和CPT1A Western blotting结果

表3 各组大鼠肝脏组织中ACOX1和CPT1A蛋白相对表达量（）

表3 各组大鼠肝脏组织中ACOX1和CPT1A蛋白相对表达量（）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与阳性药物组比较，P＜0.05

组别正常组模型组阳性药物组决明子蒽醌苷低剂量组决明子蒽醌苷中剂量组决明子蒽醌苷高剂量组CPT1A/GAPDH 1.14±0.17 0.28±0.08*0.49±0.07*#0.46±0.05*#0.48±0.03*#0.62±0.04*#△鼠数10 10 10 10 10 10 ACOX1/GAPDH 0.82±0.12 0.14±0.03*0.45±0.06*#0.42±0.06*#0.46±0.05*#0.57±0.06*#△

2.5 大鼠ACOX1 和CPT1A 的mRNA 表达与正常组相比，模型组、阳性药物组和决明子蒽醌苷3 个剂量组大鼠肝脏组织中ACOX1 和CPT1A 的mRNA 表达均降低（P＜0.05），决明子蒽醌苷低剂量和中剂量组以及阳性药物组基本一致，高剂量组高于阳性药物组（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肝脏组织中ACOX1和CPT1A的mRNA相对表达量（）

表4 各组大鼠肝脏组织中ACOX1和CPT1A的mRNA相对表达量（）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与阳性药物组比较，P＜0.05

CPT1A mRNA 1.00±0.00 0.37±0.07*0.55±0.04*#0.56±0.03*#0.58±0.06*#0.65±0.06*#△组别正常组模型组阳性药物组决明子蒽醌苷低剂量组决明子蒽醌苷中剂量组决明子蒽醌苷高剂量组鼠数10 10 10 10 10 10 ACOX1 mRNA 1.00±0.00 0.29±0.05*0.52±0.07*#0.54±0.06*#0.56±0.09*#0.72±0.011*#△

3 讨论

决明子别名草决明、钝叶决明、马蹄决明、假绿豆等，主要产于我国河南、四川、安徽等地。是药食两用品［7］。在祖国传统医学中有其药理活性的详细记录，《本草纲目》中记载，决明子味甘、苦、咸，有除肝胆风热，淫肤白膜，青盲的作用；《本草正义》中认为决明子明目，可滋益肝肾，润肠通便，是培本之正治［8］。现代中医对其进行了完善，认为决明子除护肝明目、通便功效外，还有多种药理活性，如刘菊秀等［9］研究报道决明子具有降血压作用；何菊英等［10］研究显示决明子具有降血脂作用；阎君宝等［11］报道决明子可以抑制营养性肥胖大鼠体质量增加等。之后许多学者［12-14］研究结果提示，发挥降压和调节血脂等多种生物活性的主要为决明子蒽醌、吡酮和脂肪酸类等，其中又以决明子蒽醌苷活性最高。为此本研究采用决明子蒽醌苷治疗模型大鼠NAFLD。

高脂高糖饮食构建的NAFLD 大鼠模型最大的特点为血脂和肝功能异常，而已有文献证实决明子提取物对血脂和肝功能具有明显作用，如决明子水提物对小鼠高血脂具有明显降低作用，作用机理与其降低血清 TC 和 TG 密切相关［15］。还有学者［16］构建了CCl4致肝功能损伤模型，发现蒽醌类可以改善大鼠肝功能指标血清ALT、ALP 和AST 等的含量。本研究中采用高脂高糖饮食构建NAFLD大鼠模型，结果显示与正常组相比，模型组AST、ALT、TG 和TC 均升高。此外，大鼠肝脏病理学显示，模型组大鼠有明显的脂肪空泡和炎症反应，证明NAFLD 模型构建成功；之后采用决明子蒽醌苷干预，研究结果和上述文献报道一致，决明子蒽醌类化合物可以改善大鼠肝功能，降低血脂。

NAFLD 发病机制较为复杂，涉及氧化应激、炎症反应、ROS等［17-20］，但无论哪种发病机制，都涉及脂肪酸氧化，脂肪酸氧化主要有α、β和ω3 种方式，其中α氧化主要涉及脂肪酸的合成，β氧化为体内主要脂肪酸分解过程，其代谢酶活性的高低决定肝脏脂肪的排出，在脂酸β 氧化中，线粒体是主要活动场所［21］。正常情况下，人体摄入的脂酸可在细胞质内活化为脂酰辅酶A，然后脂酰辅酶A进入线粒体在脂肪酸β氧化相关酶的作用下分解释放能量供机体利用。脂酰辅酶A 由于分子量较大，不能直接进入线粒体，此时需要和肉碱结合促进其转运，CPT1A 是催化脂酰辅酶A 结合的酶，因此其含量的高低直接决定长链脂肪酸是进入线粒体还是存储于胞质［22］。在脂肪酸进入线粒体后，β氧化酶系之一ACOX1 又在其中占有重要地位，ACOX1 是过氧化体氧化增殖的标志，有研究［23］显示ACOX1基因敲除小鼠缺乏ACOX1，肝细胞严重脂肪变性和自发过氧化体增殖，进一步证实了ACOX1 在 NAFLD 中的作用 ，因此本研究以 CPT1A 和ACOX1 为靶点，考察决明子蒽醌苷对其的作用，本研究结果显示，决明子蒽醌苷可以增加NAFLD 大鼠肝脏中CPT1A与ACOX1蛋白和mRNA的表达。

综上所述，本研究结果表明，NAFLD 大鼠肝功能明显异常，决明子蒽醌苷可以改善肝功能，降低血脂，这可能与决明子蒽醌苷可以上调脂肪酸β氧化关键酶CPT1A和ACOX1表达有关。