植物原生质体再生细胞壁研究进展

杨 颖，康 兰，耿 新，陈玉珍，卢存福

（北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083）

0 引言

细胞壁是植物细胞的重要特征，若没有细胞壁，植物将是一堆柔韧的原生质体[1]。同时，作为植物区别于动物的一个进化特征，细胞壁形成和调控的分子机制一直是有待研究的基础科学问题。2005年，《Science》在其创刊125周年时就提出把“植物如何形成细胞壁”作为接下来25年需要解决的重要科学问题之一[2]。

植物细胞在去除细胞壁后能迅速地重新合成新的细胞壁[3-4]，因此植物原生质体是研究细胞壁再生的良好材料[5-6]。过去对植物细胞壁的研究多从生化角度出发，主要集中在细胞壁结构与功能、化学组分和物理特性及应用上[7-9]。从细胞学的角度更能整体把控细胞壁代谢的全过程，原生质体为单细胞且具有全能性，非常适合用于研究植物生物学的基本问题，如膜生理学、细胞壁代谢和应激反应[10-11]。细胞壁的生物合成是非常动态、复杂的网络架构，借助原生质体可再生壁这一特性，人们逐渐揭开了细胞壁合成的面纱[11]。1967年，Pojnar等[12]利用光学显微镜及电子显微镜观察到番茄果实原生质体细胞壁再生过程。之后越来越多物种的原生质体经培养观察到新生细胞壁，推动了可视化细胞壁再生动力学研究的发展。每个植物基因组都包含数千个与细胞壁形成相关的基因[13-15]，随着第二、三代测序技术的兴起，原生质体再生细胞壁的过程结合组学成为新的研究方向，可解释原先无法解释的植物细胞壁形成的机理和调控的分子机制，并鉴定出细胞壁合成关键基因[16]，为后续基因功能特性分析奠定基础。因此，研究原生质体再生细胞壁，将有助于更加深入地了解细胞壁合成及修饰的过程，对于定向改良细胞壁、指导林木培育、发展生物能源均具有重要意义。

1 原生质体再生细胞壁培养

1.1 原生质体再生壁材料的选择

一般来说，单子叶植物例如水稻、玉米、小麦的原生质体再生壁过程较双子叶植物更为困难，所以取材上也更加精细。对于单子叶植株，选取幼嫩的叶片及根部游离原生质体很难再生出细胞壁，研究者开始选择分裂能力强、生长旺盛的组织如分生组织用来再生植株，后续逐渐选用胚性愈伤、悬浮细胞系等作为实验材料，并成为主流。例如Mujahid等[17]利用水稻悬浮细胞系(NB2P cells)成功培养得到水稻原生质体再生的细胞壁，并利用新生壁为后续的转录组相关实验奠定基础。岳晋军[18]同样选取毛竹胚性悬浮细胞构建毛竹原生质体再生体系，再生效率最高。但选用胚性愈伤、悬浮细胞系也存在弊端，因为悬浮培养的建立和维持往往费时费力，从而增大研究成本。双子叶植物的原生质体再生较为简单，一般选取幼嫩叶片即可获得原生质体的再生壁。番石榴[19]、拟南芥[20]、矮牵牛[21]、豆科植物[22]均可利用幼嫩的叶片游离原生质体进行细胞壁再生。与双子叶植物等维管植物相比，苔藓植物和蕨类植物具有相对简单的细胞结构，因此细胞壁再生过程更加容易[23-24]。

1.2 培养基的选择

植物原生质体经提取、纯化的步骤后进入培养阶段。尽管Pilet等[25]在1984年提出植物原生质体不能再生出正常的细胞壁，但之后又有报道表明其在合适的培养基中也可生成正常的细胞壁[24]。因此不同物种的培养基可能存在差异，选择合适的培养基十分关键。使用频率较高的基本培养基为MS、KM8P、B5，培养基中常辅以碳源、渗透压稳定剂、少量植物激素和小分子营养素等[26]。其中，KM8P培养基营养最丰富，接受度最高，影响最为广泛。

KM8P培养基最早是由Kao and Michayluk于1975年提出，它使蚕豆原生质体细胞能够以极低的初始种群密度（25～50个细胞/mL）生长，同时证明了单个原生质体能够形成细胞壁[27]。首次阐明添加氨基酸和椰子水能够帮助原生质体细胞在低密度条件下存活，因其提供了许多代谢的中间产物，同时具有解毒作用。

但并非所有的物种都适用于KM8P培养基，多数研究者会根据自己的材料以及研究意图选择最为合适的培养基。作为典型的单子叶植物，毛竹悬浮细胞原生质体培养采用以MS为基础的培养基，并添加各类维生素及氨基酸等增加原生质体活性[18]。作为双子叶植物的草香豌豆和黄羽扇豆则不需要过于丰富的培养基，Wiszniewska等[22]发现培养基越丰富，原生质体保持活性的能力越差，他们改良原有AS培养基，加速了原生质体表面纤维素的合成。因此，对于刚失去细胞壁保护的原生质体来说，选择合适的培养基对长出新生细胞壁至关重要，并且一般来说单子叶植物较双子叶植物再生壁过程困难，所以单子叶植物的培养基更加丰富。

1.3 培养方式的选择

原生质体培养存在多种新旧方式，因不涉及后续细胞团生成和植株再生，原生质体再生细胞壁培养通常选用液体浅层培养(liquid thin culture)。Wiszniewska等[22]在直径为4 cm的塑料培养皿里使用液体浅层培养的方法，成功再生出豆类植物原生质体细胞壁。相较于固体培养或固液结合培养，液体浅层培养方法简单、损害小，对于再生细胞壁这一阶段十分适用。但是这种方法也存在不足，如原生质体分布不均，长壁的原生质体易粘黏成细胞团，不利于观察单个细胞且影响进一步的细胞壁发育等。

原生质体植板密度也影响着其存活率。密度过高时，由于缺乏营养元素或有害的代谢中间产物增多，原生质体无法正常生长；密度过低时，不利于寻找长出细胞壁的原生质体。在原生质体再生细胞壁这一阶段，植板密度一般控制在1×105个/mL较为适宜。

因此，培养条件的好坏决定直接影响着原生质体的存活率，它作为关键的一环甚至决定整个实验的成败。为高效再生出原生质体新生细胞壁，应注意以下几个方面：（1）根据前人研究，多尝试几种培养基，不同的物种对培养基的营养程度喜好不一；（2）原生质体十分脆弱，操作过程中应尽量减少机械性损伤；（3）若原生质体长时间没有长壁，还应考虑取材部位是否正确。

2 细胞壁再生的细胞生物学证据

原生质体再生的细胞壁在普通光学或相差显微镜下无法得以观察，所以需利用化学染料与细胞壁中的物质结合，再借助荧光显微镜才能判断细胞壁生成与否。荧光增白剂卡式白(Calcofluor White)自1970年发现可使细胞壁在荧光显微镜紫外光下呈蓝色[28]，直至现在仍是主流应用于细胞壁可视化的经典染料。这种荧光染料对纤维素和几丁质具有很强的亲和力，很多物种的原生质体细胞壁再生实验均使用了该染料检测。尽管卡式白染料染色过程简单、快速，但它对纤维素微纤丝的特异性不强且对活细胞有毒害作用。近年来，Pontamine Fast Scarlet 4 BS这种新型细胞壁染料兴起，它对纤维素微纤丝有很高的特异性，与卡式白染料相比，其最大的优势在于可使活细胞染色[29-32]，更有利于活体原生质体的实时检测，便于得到立体的细胞壁再生图。

通过历代科研工作者的努力，人们对原生质体再生壁的观察不再局限在二维层面，而是从三维立体的角度研究再生过程中纤维素微纤丝沉积规律。Kuki等[33]将传统的纤维素染色技术与图像分析相结合，设计出一种新的成像技术来定量评估拟南芥花叶原生质体细胞壁再生过程中的纤维素网络结构（图1[33]）。三维成像的方式打破了人们对细胞壁固有的认知，细胞壁的纤维素微纤丝的总长度、分布的密度和平均角度等关键指标都可用此方式生动地呈现出来，可直接观察到拟南芥原生质体再生的早期阶段表现为纤维素微纤丝的随机取向，随后是部分纤维素微纤丝的定向沉积最后才是有序的纤维素沉积。不仅如此，细胞壁可视化的应用使人们更加形象、立体、全面地观察到原生质体新生壁。因每种植物细胞壁纤维素微纤丝累积模式不尽相同[34-37]，该技术除了可以比较再生过程中细胞壁的变化，还可为不同植物细胞壁动力学的显著差异提供新的见解。

图1 原生质体细胞壁再生的时间进程

3 组学技术研究原生质体再生细胞壁的细胞分子生物学过程

细胞壁再生相关蛋白约占细胞壁质量的10%，通常由大的基因家族编码[38-39]，这些蛋白质在维持细胞壁结构稳定性和功能多样性上发挥重要作用。但是目前为止，仍存在大量未被挖掘出来的细胞壁蛋白，因此在原生质体单细胞的基础上，结合多种组学的系统研究方法[40]，已成为人们深入了解细胞壁再生分子机制的新方向。不同的组学手段适用于解释原生质体再生细胞壁分子网络的不同层面，可归纳为以下3点。

3.1 获得差异表达基因

在细胞壁再生的不同时间点取样，通过转录组或蛋白组获得再生壁过程中各阶段的差异表达基因，分析筛选出关键基因，构建细胞壁再生模型。2005年Kwon等[41]通过比较细胞壁再生0、1、3 h后拟南芥原生质体的蛋白组变化情况，发现细胞壁再生1 h内，AtXTH11(At3g48580)、AtXYL1(At1g68560)等蛋白便开始合成细胞壁再生的结构基础纤维素/木葡聚糖网络。Yang等[42]利用转录组技术，根据棉花细胞壁再生的不同时期，把上调表达的210基因标签分成细胞壁再 生 前 期 (TIP、EXLA2、BIK1)、中 期 (PRP、GRP、ANAC016)、后 期 (CIPK9、FLA2、SUS2)、整 个 阶 段(SMADC)4类。由此可见，植物细胞壁分子网络已初具雏形，为单基因功能验证以及信号转导途径鉴定奠定了基础。

3.2 细胞壁再生与细胞内部的关联网络

目前，组学技术已深入至亚细胞水平，有助于系统深入地了解细胞器与细胞壁再生的内部响应机理。众所周知，细胞壁的酶解对植物细胞而言属于外界的胁迫刺激，因此细胞核会对该刺激触发响应机制，从而参与细胞壁再生的分子网络构建。有研究利用核蛋白组学技术证实水稻细胞壁去除后染色质中组蛋白H3K23高度乙酰化，组蛋白变体如H3.3等表达量降低。但随着细胞壁的再生，H3K23乙酰化程度立即下降，组蛋白变体表达量上调[43]。由于高尔基体在植物中主要参与细胞壁中多糖的合成、蛋白质糖基化和囊泡形成，与细胞壁再生息息相关[44]。Parsons等[45]根据拟南芥高尔基体蛋白组发现，GNT1(AT4G38240.1)、XYLT(AT5G55500.1)和 FUT12(AT1G49710.1)主要参与的N-糖基化途径和GT65参与的O-岩藻糖基化途径在细胞壁合成中发挥重要作用。以上研究表明细胞壁再生过程是一个复杂的生命活动，需要多种细胞器配合完成，但目前其他细胞器对细胞壁合成的分子机制是否有响应尚未明确。

3.3 细胞壁再生网络的调控枢纽-磷酸化修饰

磷酸化作为一种最常见的翻译后修饰，具有重要的调节作用。2014年，Wang等[46]对小立碗藓原生质体再生的磷蛋白组进行了综合分析（图2[46]），鉴定出108个磷酸化蛋白可能参与调控细胞壁生成、细胞结构变化、细胞增生和分化、器官发生和发育调节。虽然该团队构建出了小立碗藓原生质体再生的磷酸化蛋白代谢网络，但并未从分子层面解释蛋白质的互作关系。后来，刘玉薇和王晓琴[47]在Wang等研究的基础上构建了小立碗藓原生质体再生的蛋白互作网络，发现转录因子AGL21磷酸化可与20个蛋白发生互作，促进植物的生长发育；VIP4可与VIP3和ELF8蛋白发生互作，其中ELF8还和组蛋白甲基化有关，同时表明细胞核与细胞壁再生密切相关。组学技术随时间不断发展，磷蛋白组的应用加深了人们对蛋白相互作用的理解，为进一步阐明原生质体再生过程的分子调控机制提供了理论依据。

图2 裸藻原生质体再生过程的分子调控网络与细胞反应

4 展望

近十几年来，培养技术的更新及新技术的应用使得植物原生质体细胞壁再生方面的研究取得了长足的进展。细胞壁再生过程中涉及诸多生理生化反应，虽然可通过基因组、蛋白组构建出细胞壁再生的分子网络，但对于细胞壁再生机理尚处于浅层次认识的阶段，可从以下3个方面进一步深入研究：（1）分析得到的关键蛋白如何指导细胞壁的发生、修饰以及它们之间的信号转导通路的构建仍不清晰；（2）原生质体中细胞壁的再合成和胞质分裂过程中新细胞壁的合成是否遵循相同的调控机制并使用相同的一组催化酶；（3）影响原生质体再生的因素很多，细胞内部中存在多种细胞器及细胞骨架共同指导完成细胞壁再生，目前只有高尔基体、细胞膜、细胞核证实与细胞壁再生有关，但其所描述的分子网络尚未完善。已有研究表明，外部环境有多种胁迫应激影响细胞壁合成，例如冷、热、重金属胁迫等[48-49]，甚至太空中的微重力环境也会抑制原生质体的细胞壁再生能力[50]，而外部环境如何刺激影响细胞壁再生，也是值得研究的问题。