超临界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖工艺研究

谭兰芳，许文珍，杨跃歌，孟繁钦(牡丹江医学院药学院，黑龙江 牡丹江 157011)

0 引言

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)为茜草科耳草属的一年生披散草本植物，化学成分主要含有黄酮类、蒽醌类、萜类、甾醇类、多糖类、有机酸类等。其中的多糖成分具有抗突变的作用，能够预防肿瘤的出现和抑制其生长繁殖，而且还能够增强免疫力和抵抗衰老延长寿命。本研究在单因素实验的基础上，采用正交实验法，考察超临界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖工艺中的萃取压力、萃取温度、携带剂(乙醇)浓度和料液比对粗多糖萃取率的影响，优选出最佳萃取工艺，并利用苯酚—硫酸比色法测定最佳工艺条件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的含量。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

白花蛇舌草，安徽汉枫中药饮片有限公司；CO2气体，牡丹江市金瑞气体有限公司；无水乙醇(分析纯)，哈尔滨试剂化工厂；葡萄糖(分析纯)，天津市永大化学试剂有限公司；苯酚(分析纯)，沈阳试剂一厂；硫酸(分析纯)，淄博库仑分析仪器有限公司；HA220-50-60型超临界萃取装置，江苏南通市华安超临界萃取有限公司；R205B型旋转蒸发仪，上海申胜生物技术有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超临界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖

称量50 g过100目标准药筛的白花蛇舌草粉末，装入料筒后，将其置于1 L萃取釜中借助压环和上堵头进行密封，通入携带剂乙醇，待萃取温度及萃取压力至设定值后，进行循环萃取并开始计时，达到萃取时间后，依次收集分离釜Ⅰ、Ⅱ内的萃取物，备用。

取出旋转蒸发仪的收集瓶，装入收集得到的萃取物。当旋转蒸发仪水浴温度达到50 ℃时，启动真空泵，开始减压蒸馏，待萃取物呈现糊状后停止并取出。将糊状物置于电热鼓风干燥箱中干燥4 h，得到粗多糖，精确称量其质量并计算萃取率。白花蛇舌草粗多糖萃取率计算公式为：

1.2.2 白花蛇舌草粗多糖萃取工艺单因素实验

为给正交实验水平选取提供依据，在固定分离压力及分离温度的前提下，借助单因素实验法，分别考察不同萃取压力(10、20、30、40、50 MPa)、萃取温度(20、30、40、50、60 ℃)、乙醇浓度(10%、30%、50%、70%、90%)及料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)对粗多糖萃取率的变化影响。

1.2.3 正交优化超临界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖实验

依据单因素实验结果，以白花蛇舌草粗多糖萃取率为评价指标，设计4因素3水平正交实验，各因素与水平情况，见表1。综合文献报道，正交实验的萃取时间设置为1 h。

表1 正交实验因素与水平表

1.2.4 白花蛇舌草粗多糖的含量测定

(1)标准曲线的制作。将无水葡萄糖标准品干燥至恒重，精确称取0.02 g置于容量瓶中，加适量蒸馏水溶解后定容至100 mL，制得0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液。取10 mL容量瓶5个，分别精密吸取2、2.5、3、3.5、4 mL葡萄糖标准溶液加入其中，蒸馏水定容至刻度。精确吸取各种溶液1 mL置于5个试管中，再向各试管精确添加1 mL的5%苯酚溶液后，迅速滴加98%的浓硫酸，混匀，沸水浴10 min后，冷却20 min，用紫外分光光度计在490 nm最大吸收波长处测定其吸光度值，纵坐标为吸光度值，横坐标为样品浓度，建立标准曲线，其线性回归方程为：

式中：A为吸光度值；C为样品质量浓度(mg/mL)。

(2)白花蛇舌草粗多糖的含量测定。精确称取一定量的干燥粗多糖，适量蒸馏水溶解后，定容至150 mL容量瓶中，作为供试品溶液。按照苯酚-硫酸法测定其吸光度，代入回归方程计算多糖的含量，计算公式如下：

式中：C为白花蛇舌草多糖浓度；D为分取的倍数；W为白花蛇舌草称取量。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 萃取压力对白花蛇舌草粗多糖萃取率的影响

萃取温度40 ℃，携带剂浓度40%，料液比1∶3的条件下，白花蛇舌草粗多糖萃取率在萃取压力30 MPa时出现最大值。萃取压力在20～30 MPa之间萃取率值变化趋势平缓，所以选定萃取压力在20～30 MPa间进行正交实验。

2.1.2 萃取温度对白花蛇舌草粗多糖萃取率的影响

萃取压力20 MPa，携带剂浓度40%，料液比1∶3的条件下，当萃取温度控制在40～50 ℃之间，粗多糖萃取率值变化平缓，且萃取温度高于50 ℃后，萃取率值不断降低，故选定萃取温度在50 ℃左右进行正交设计。

2.1.3 携带剂浓度对白花蛇舌草粗多糖萃取率的影响

萃取压力20 MPa，萃取温度40 ℃，料液比1∶3的条件下，携带剂浓度为30%时粗多糖萃取率最大，故选定携带剂浓度在30～50%之间进行正交实验。

2.1.4 料液比对白花蛇舌草粗多糖萃取率的影响

萃取压力20 MPa，萃取温度40 ℃，携带剂浓度40%的条件下，料液比在1∶6时萃取率值最高，故选定料液比为1∶6左右进行正交实验。

2.2 正交优化实验结果分析

根据4因素3水平正交实验设计，共进行9组实验，结果见表2。

由表2中实验数据可知，极差最大的为因素C，其次为因素B，再次为因素A，最小的为因素D，即超临界CO2萃取工艺中对白花蛇舌草粗多糖萃取率的因素影响主次顺序为C(乙醇浓度)＞B(萃取温度)＞A(萃取压力)＞D(料液比)。按照平均值大小选取最优水平为A2B1C3D3，即在料液比是1∶8和使用40%的乙醇，并设定萃取压力为25 MPa和萃取温度为40 ℃。

3 最优萃取工艺的验证

上述优化结果为理论分析得到，需进一步验证。按优化方案A2B1C3D3进行验证实验，平行重复3次，计算平均值。结果得出白花蛇舌草粗多糖的平均萃取率为0.364%，优于正交实验中各次的实验结果，说明此次的正交优化实验合理可行。

表2 L9(34)正交试验设计结果

4 多糖纯度的测定

利用苯酚—硫酸比色法测定最佳工艺条件下萃取所得白花蛇舌草粗多糖的纯度为66%，含量较高。

5 结语

本研究对超临界CO2萃取白花蛇舌草粗多糖萃取工艺进行了优化，即在萃取时长为1 h，使用40%乙醇为携带剂，料液比控制为1∶8，萃取压力25 MPa，萃取温度30 ℃的条件下，粗多糖的得率最高。为今后超临界CO2萃取技术应用于多糖萃取提供了有益的参考，同时为白花蛇舌草资源利用提供部分依据，具有一定实用和推广价值。