高效亲水作用色谱-蒸发光散检测应用于甘油磷酸胆碱含量测定

2021-03-24娄良中山百灵生物技术股份有限公司广东中山528437

化工管理 2021年6期

娄良(中山百灵生物技术股份有限公司，广东中山 528437)

0 引言

甘油磷酸胆碱(glycerylphosphorylcholine，简称GPC)是一种重要的药物原料。GPC的分子式为C8H20NO6P，是有甘油分子和磷酸胆碱基团脱去水分子构成，是重要的神经传递质乙酰胆碱的生物合成前体。GPC能在小肠和通过静脉注射吸收，并且能进入脂蛋白的结构中[1]，因此具有药用价值。研究表明，GPC有保肝作用[2]，有改善老年人认知能力和记忆力的作用[3]，还有多种健脑功效，因此GPC在食品、药品、化妆品领域具有重要应用价值。

GPC含量检测方法的研究有许多。早在1985年，Joseph J Billadello等[4]研究了用核磁共振磷谱对完整组织中GPC的含量进行测定，该方法回收率较高，但灵敏度低，重现性差。程琳等[5]研究了液质联用法，该方法能快速测定GPC的含量，且灵敏度高，稳定性好，但因检测成本高导致该方法应用范围不广。

本研究采用HPLC-HILIC-ELSD方法检测GPC的含量，色谱柱为Venusil HILIC色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.05 mol/L乙酸铵水溶液-(以乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8，流速1.0 mL/min，ELSD检测器，漂移管温度70 ℃。该方法分析速度快，15 min即可完成单个样品分析；主要物质GPC与其他杂质的分离度良好；log峰面积与log进样量的线性关系良好，用外标两点法对GPC进行定量结果准确；方法重现性好，该方法可用于GPC的定量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪器(岛津CBM-20A)、蒸发光散射检测器(岛津ELSD-LTII)、分析天平(赛多利斯BT125D)、Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱。

试剂：蒸馏水、甘油磷酸胆碱标准品(含量99.5%韩国药典标准品)、甘油磷酸胆碱供试品(中山百灵生物技术有限公司批号GP20630-GP20632)、乙腈(色谱纯，阿拉丁)、乙醇(色谱纯，阿拉丁)、乙酸铵(分析纯，阿拉丁)。

1.2 色谱分析条件

高效液相系统：岛津LC-20AT、等度洗脱、流速1.0 mL/min、色谱柱Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5μm)、柱温40 ℃、进样量20μL、蒸发光散射检测器、漂移管温度70 ℃、增益2(×2)、过滤器10sec、流动相为0.05 mol/L乙酸铵水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8。

1.3 GPC含量测定

取甘油磷酸胆碱(GPC)对照品适量，精密称定，用流动相稀释定容，配制成浓度为0.1 mg/mL和1 mg/mL的GPC对照溶液。

取甘油磷酸胆碱(GPC)供试品适量，精密称定，用流动相稀释定容，配制成浓度为0.5 mg/mL的GPC供试品溶液。

精密量取GPC对照溶液及GPC供试品溶液各20 μL进样。

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2 结果与讨论

2.1 色谱分析条件确定

2.1.1 色谱柱及分离体系选择

由于甘油磷酸胆碱(GPC)是水溶性且极性非常大的物质，在普通RPLC-C18体系上保留时间非常短，而GPC样品的水溶性无法选择普通的正相体系。综上所述，选择亲水作用色谱(HILIC)模式，通过对不同品牌以及不同填料的HILIC色谱柱进行筛选，最后发现丙烯酰胺键合硅胶填料的HILIC色谱柱对GPC及其杂质有较好的分离效果以及重现性，最终选择Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱。

2.1.2 流动相选择

根据亲水色谱模式的流动相选择以及样品性质，分别筛选了甲醇-水、乙腈-水、缓冲盐-甲醇-乙腈体系，根据样品分离效果、保留时间以及响应值，最终选择0.05 mol/L乙酸铵水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8作为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温40 ℃，下图1为GPC的HPLC图谱。GPC分离度大于2.0，GPC保留时间为6.662 min，可以在15 min以内快速完成样品的分析。

图1 GPC的HPLC图谱

2.1.3 蒸发光散射检测器参数的优化

ELSD作为一种通用型质量检测器，待测物经色谱分离后进入雾化器，雾化为很小的颗粒，这些雾化颗粒进入漂移管，挥发性流动相气化蒸发，剩余的微小颗粒通过光束时产生光散射效应。本实验优化了漂移管温度、增益以及过滤器等参数并以氮气为载气，结果表明60～90 ℃时响应值最高。漂移管温度过高会缩短检测器寿命，因此设置漂移管温度为70 ℃，增益2(×2)，过滤器10sec。

2.2 检测限和定量限

取甘油磷酸胆碱(GPC)适量，加流动相定量稀释后进样，记录色谱图。以信噪比约为3∶1的浓度作为检测限，信噪比约为10∶1的浓度作为定量限。实验结果表明以信噪比约为3∶1时的浓度作为检测限，甘油磷酸胆碱(GPC)的检测限为0.005 9 mg/mL，相当于样品浓度的1.2%，以信噪比约为10∶1时的浓度作为定量限，甘油磷酸胆碱(GPC)的定量限为0.011 mg/mL，相当于样品浓度的2.2%。

2.3 线性范围

2.3.1 线性溶液的配制

精密称取100 mg甘油磷酸胆碱(GPC)标准品于50 mL量瓶中，用流动相定容至刻度，制成2 mg/mL的母液。分别精密移取0.5、0.75、1.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL母液于10 mL量瓶中，用流动相定容至刻度，得到浓度分别为0.1、0.15、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的GPC标准液。

2.3.2 线性回归

取2.3.1中配制好的GPC系列标准液，分别进样20 μL，以保留时间定性，峰面积定量。以各GPC标准液的log峰面积为纵坐标Y，以该溶液的log进样量为横坐标X，进行线性回归，得到相应线性回归方程为y=1.374 9x+3.377 3(r=0.999 9)，说明甘油磷酸胆碱(GPC)在0.1～1.4 mg/mL范围内线性良好。甘油磷酸胆碱(GPC)线性回归图见图2。

图2 甘油磷酸胆碱(GPC)线性回归图

2.4 溶液稳定性试验

取甘油磷酸胆碱(GPC)标准品适量，精密称定，用流动相稀释定容，配制成浓度为1.0 mg/mL的GPC标液，每2 h进样1次分析，共测定6次，实验周期为12 h，结果表明计算GPC标液在12 h内稳定性好，峰面积计算RSD为0.65%。

2.5 精密度以及方法回收率

2.5.1 重现性

配制的浓度为0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的GPC系列标准溶液，分别进样20 μL，每个溶液连续进三次。三个浓度下的9次连续进样的GPC响应值Rf(log进样量/GPC log峰面积)RSD为0.58%，结果小于2.0%，说明该方法的重现性好。

2.5.2 中间精密度

不同日期不同检测人员重复重现性实验结果，GPC响应值(log进样量/GPC log峰面积)RSD为0.88%，结果小于2.0%，说明该方法中间精密度好。

2.5.3 方法回收率

取已知甘油磷酸胆碱(GPC)含量的甘油磷酸胆碱(GPC)供试品6份，精密称定，加入甘油磷酸胆碱(GPC)对照品0.5 mg/mL，用流动相溶解混匀后按1.2项下的方法进行测定，记录色谱图。实验结果表明6份样品加入同一浓度回收溶液得到甘油磷酸胆碱(GPC)的回收率均在98%～101%之间，且RSD＜1.0%，说明该方法准确性良好。