液相色谱-串联质谱法测定护肤类化妆品中5种棕榈酰多肽

(广州质量监督检测研究院，广州 510110)

多肽在化妆品中的使用已有20 多年，仅2017年国内与多肽相关的化妆品行业市场规模已经达到34.02亿元，产量约81.5 t[1-4]。生物活性多肽来源于皮肤中主要胞外蛋白的酶解，可调节胶原蛋白、弹性蛋白和黑色素的合成，有广谱的抗微生物活性，被应用于应对皮肤老化和光老化、伤口愈合等问题。在生物活性多肽中引入酯基团可极大地增进其透肤性[5-7]。来源于细胞因子的棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-3、棕榈酰四肽-7和棕榈酰六肽-12均被证明具有促进胶原蛋白合成，改善皮肤老化的效果[6-11]。棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-5 是合成信号多肽，可激活组织生长因子(TGF-β)，促进胶原蛋白合成[6，12-13]。因此，棕榈酰多肽作为护肤类化妆品的功效原料被使用。

生物活性多肽的测定方法多为质谱法。文献[14]建立了鸡汤中的肌肽和鹅肌肽测定方法，方法采用反相吸附剂材料去除鸡汤中的盐，采用液相色谱-串联质谱法测定目标物。文献[15]建立了化妆品中多肽的测定方法，样品加入氯化钠和乙酸后，用甲醇提取，采用液相色谱-串联质谱法测定目标物。文献[16]建立了化妆品中寡肽-20 和寡肽-24 的测定方法，样品经乙腈-甲酸铵缓冲盐溶液提取后用液相色谱-质谱法测定目标物。文献[17]建立了测定化妆品中六肽的基质辅助激光解吸-质谱法。

本工作采用液相色谱-串联质谱法测定护肤类化妆品中棕榈酰五肽-3、棕榈酰四肽-7、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、棕榈酰六肽-12等5种棕榈酰多肽的含量，方法的建立对化妆品质量监管具有重要意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000-TSQ Quantiva 型液相色谱-串联质谱仪；Minishaker MS3 digital型涡旋混合仪；SK 8200H 型超声波清洗仪；Mill-Q 型超纯水仪。

棕榈酰五肽-3、棕榈酰四肽-7和棕榈酰三肽-1的标准储备溶液:1.00 g·L－1，分别称取适量的棕榈酰五肽-3、棕榈酰四肽-7和棕榈酰三肽-1的标准品于10 mL容量瓶中，用80%(体积分数，下同)甲醇溶液定容，摇匀，于4 ℃存放。

棕榈酰三肽-5和棕榈酰六肽-12的标准储备溶液:1.00 g·L－1，分别称取适量的棕榈酰三肽-5和棕榈酰六肽-12的标准品于10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，摇匀，于4 ℃存放。

5种棕榈酰多肽的混合标准溶液:20.0 mg·L－1，分别移取适量的5 种棕榈酰多肽的标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用90%甲醇溶液定容，摇匀，于4 ℃存放。

提取剂:含0.1 mol·L－1乙酸铵的95%甲醇溶液。

棕榈酰五肽-3标准品和棕榈酰四肽-7 标准品的纯度均为94%，棕榈酰三肽-1和棕榈酰三肽-5标准品的纯度均为93%，棕榈酰六肽-12标准品的纯度为91%。

甲醇、乙醇、乙腈、乙酸均为色谱纯；乙酸铵为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 LIChrospher®60RP-select B色谱柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；流量1.0 mL·min－1；进样体积5μL。流动相:A 为含0.3%(体积分数，下同)乙酸的50 mmol·L－1乙酸铵溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～6 min时，B 由50%升至65%；6～7 min时，B由65%升至95%，保持3 min；10～11 min时，B由95%降至50%，保持5 min。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，负离子模式和正离子模式；喷雾电压3 000 V；气化器温度320℃，传输管温度325℃；选择反应监测(SRM)模式。其余质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

对于乳液样品和膏霜样品，称取约0.2 g样品于刻度管中，用提取剂定容至10.0 mL，涡旋0.5 min，超声提取20 min，取出冷却至室温。提取液经滤膜过滤后，取滤液按仪器工作条件进行测定。

对于水剂样品，称取约0.2 g样品，用提取剂定容至5.0 mL，涡旋混匀。提取液经滤膜过滤后，取滤液按仪器工作条件进行测定。

1.3.2 结果计算

样品中目标物含量按公式(1)计算:

式中:w为目标物的质量分数，mg·kg－1；ρ为样品分析结束后根据标准曲线计算得到的目标物的质量浓度，μg·L－1；V为定容体积，m L；m为称样量，g。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件对200.0μg·L－1的5种棕榈酰多肽的混合标准溶液进行测定，5种棕榈酰多肽混合标准溶液的色谱图见图1。

2.2 仪器工作条件的选择

因为棕榈酰多肽具有一定的离子性，所以棕榈酰多肽尤其是棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5在常规的C18色谱柱中有拖尾效应，即使采用50 mmol·L－1乙酸铵溶液作为流动相的水相，拖尾效应仍较严重。耗材调研发现:LIChrospher®60RP-select B 碱性化合物分析专用色谱柱的键合相为改性C8疏水基团，孔径6 nm，可以大大降低表面硅醇基团暴露在流动相中的几率，改善碱性化合物的拖尾效应。试验选用LIChrospher®60RP-select B色谱柱。

试验考察了流动相的水相依次为0，10，20，50，100 mmol·L－1乙酸铵溶液时对5种棕榈酰多肽测定的影响。结果表明:乙酸铵的浓度为50，100 mmol·L－1时，5 种棕榈酰多肽的拖尾效应很弱，但是乙酸铵溶液浓度为100 mmol·L－1时，5种棕榈酰多肽的响应显著降低。试验选择乙酸铵的浓度为50 mmol·L－1。试验还考察了50 mmol·L－1乙酸铵溶液中乙酸的体积分数依次为0，0.1%，0.2%，0.3%时对5种棕榈酰多肽测定的影响。结果表明:乙酸的体积分数为0.3%时，5种棕榈酰多肽的响应最大，且信噪比得到了很大的改善。试验选择乙酸的体积分数为0.3%。试验选择流动相的水相为含0.3%乙酸的50 mmol·L－1乙酸铵溶液。

图1 5种棕榈酰多肽混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of 5 palmitoyl polypeptides

对流动相的梯度洗脱程序进行了适度优化后，试验选择的梯度洗脱程序见1.2节。在此梯度洗脱程序下，5 种棕榈酰多肽的峰形尖锐，峰宽约0.2 min。

化合物母离子的离子源条件通过TSQ Quantiva 2.0 Tune软件人工优化得到，子离子选择和碰撞电压通过TSQ Quantiva 2.0 Tune软件自动优化得到，试验选择的质谱条件见1.2节。

2.3 提取剂的选择

棕榈酰多肽在高含量的甲醇溶液中有较高的溶解度，且高含量的甲醇溶液可以将膏霜样品和乳液样品中常含有的黄原胶等胶质沉淀下来，避免胶质堵塞滤膜或色谱柱。在提取剂中加入乙酸铵可以更好地促进棕榈酰多肽的溶解，避免滤膜和仪器管路阻隔造成的吸附损失。试验采用的提取剂(含0.1 mol·L－1乙酸铵的95%甲醇溶液)既含有乙酸铵又含有高含量的甲醇。

2.4 基质效应

分别采用提取剂和空白基质(乳液、膏霜)配制20.0μg·L－1的5种棕榈酰多肽的混合标准溶液，按仪器工作条件进行测定。用空白基质混合标准溶液中化合物的响应与提取剂混合标准溶液中对应化合物的响应的比值表示基质效应，5种棕榈酰多肽的基质效应见表2。

表2 5种棕榈酰多肽的基质效应Tab.2 Matrix effect of 5 palmitoyl polypeptides

由表2可知:基质效应可以忽略。

2.5 标准曲线和测定下限

移取适量的5种棕榈酰多肽的混合标准溶液，用提取剂稀释，配制成0，2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0，200.0μg·L－1的混合标准溶液系列。按仪器工作条件对上述混合标准溶液系列进行测定，并绘制标准曲线。结果表明:5种棕榈酰多肽的质量浓度均在2.0～200.0μg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表3。

根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N)，结果为2.0μg·L－1。

表3 线性回归方程和相关系数Tab.3 Linear regression equations and correlation coefficients

2.6 准确度和精密度

按试验方法对水剂、乳液、膏霜等3种空白护肤类化妆品样品进行加标回收试验，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。

由表4可知:回收率为89.4%～111%，RSD 为1.1%～10%，方法的准确度和精密度较好。

加标空白膏霜样品的色谱图见图2。

2.7 样品分析

按试验方法对7批广州某品牌护肤类化妆品样品进行分析，样品中均未检出5种棕榈酰多肽。

表4 准确度和精密度试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for accuracy and precision(n＝6)

本工作建立了液相色谱-串联质谱法测定护肤类化妆品中5种棕榈酰多肽的分析方法。方法操作简便，测定结果准确可靠，适用于护肤类化妆品中5种棕榈酰多肽含量的测定。本方法可为国内化妆品行业的产品研发和产品质量控制提供重要技术支撑，对护肤类化妆品中其他棕榈酰多肽产品的分析有一定的参考意义，具有较好的应用前景。

图2 加标空白膏霜样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank cream sample mixed with standards