基于基因组步移模块的生物化学实验教学探讨

李法君，付春鹏，刘 杰，李宗珍，王爱丽，乔 宁

（潍坊科技学院贾思勰农学院，山东寿光 262700）

0 引言

作为生命科学的核心课程，生物化学主要是应用化学的理论和方法，在分子水平上阐明生物现象的一门科学。它既是学习生命科学的基础，又是研究生命本质的前沿，在本科教学中起着举足轻重的作用［1-3］。生物化学的众多研究成果都是源于实验基础，因此实验课程是生物化学学习的重要环节［4］。而在生物化学实验课中，如何提高学生的实验技能，加强对理论知识的理解和应用；如何提升学生的创新能力，建立发现问题、分析问题和解决问题的思维体系，为将来的科研工作打下基础，就成为当前生物化学实验课程值得思考和探究的问题。

生物化学实验通常可分为基础验证性实验和综合性实验。前者实验结果是已知的，学生只要按照既定的实验步骤完成实验即可［5］。学生创新能力的培养和思维水平的提高主要是依靠综合性实验。而从实际授课情况来看，多数院校的综合性实验是独立设立的，实验项目之间没有衔接性和过渡性；而且多数实验内容老旧，没有与前沿的生物化学技术接轨，学生的综合能力得不到提高［6-7］。

基于此，团队成员以较为前沿的“基因组步移技术”为主线，将基因组DNA的提取、酶切连接、引物设计、聚合酶链式反应（PCR）等实验单元串联成一个有机整体，形成一个内容相关、层第推进、方法多样的综合性实验，并且在实施过程中，可充分调动学生的能动性，取得良好的授课效果。

1 课程设计

1.1 实验原理

基因组步移是指通过分子生物学手段获得已知核酸序列的侧翼未知序列技术，主要用于［8］：①根据目标基因的cDNA序列，克隆其启动子序列和调控序列；②鉴定转座子或转座子的插入点；③染色体测序中的空隙填补等。目前，基于酶切连接的PCR法是最为常用的基因组步移方法。其原理是将基因组DNA 用限制性内切酶进行酶切，然后用T4 连接酶将接头序列加到酶切好的DNA 片段上。根据已知基因的cDNA 序列设计两条引物（SP1 和SP2），用SP1 引物和已知的AP1 引物进行第1 轮PCR外扩；以外扩PCR产物为模板，用SP2 引物和AP2 引物进行第2 轮PCR 内扩，获得的PCR产物即为目的基因［9-10］。

1.2 实验目的与材料

本实验以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的类胰岛素促雄腺基因（Insulin-like androgenic gland hormone，IAG）为研究对象，通过基因组步移技术获得Es-IAG的5'侧翼序列。Es-IAG基因的cDNA序列来源于前期构建的转录组文库（NCBI-SRA 登录号：SAMN06204640）［11］。

1.3 课程设计

生物化学实验课授课对象为农学院生物技术专业大三本科生。课程将项目内容分解为5 次课（见表1），包括4次实验课和1次汇报总结，课时数为12 学时，除PCR反应为4学时外，其余均为2 学时，在固定的教学时间段内都可完成，适合本科生的课堂教学安排。为了提高生物化学实验课的教学效果，安排2人1组。

表1 实验内容及安排

2 实验过程

2.1 DNA的提取

剪切中华绒螯蟹约20 mg的肌肉组织，匀浆破碎。加入200 μL Buffer GA，20 μL Proteinase K，55 °C温浴，将组织完全溶解。然后按DNA提取试剂盒说明进行操作。

2.2 酶切加接头

将DNA进行酶切，体系如下：基因组DNA 5 μL，内切酶1.6 μL，Buffer 2 μL，dd H2O 补足到20 μL。37 °C酶切过夜。将酶切后的DNA与接头序列进行连接反应，体系如下：酶切产物4.7 μL，接头2 μL，Buffer 0.8 μL，T4 连接酶0.5 μL，16 °C孵育1 h。

2.3 引物设计

依据Es-IAG的cDNA序列，遵循引物设计的原则进行SP1 和SP 2 引物的设计。具体序列如表2 所示。

表2 基因组步移的引物序列

2.4 基因组步移的PCR反应

将连接液稀释10 倍后，取1 μL 作为第1 轮反应的模板。用SP1 于AP1 配合进行第1 轮外扩，然后取外扩产物稀释100 倍后，取2 μL作为第2 轮反应的模板。PCR反应体系如下：dd H2O 20.5 μL，PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，AP 引物0.5 μL，SP 引物0.5 μL，Polymerase Mix 0.5 μL。第1 轮反应程序如下：7个循环：94 °C 25 s，72 °C 3 min，32 个循环：94 °C 25 s，67 °C 3 min，67 °C 终延伸7 min。第2 轮反应程序如下：5 个循环：94 °C 25 s，72 °C 3 min，20 个循环：94 °C 25 s，67 °C 3 min，67 °C 终延伸7 min。琼脂糖检测反应产物，然后送公司测序［12-13］。

3 实验结果

对各个小组的实验结果进行比较后，选取典型的实验结果进行分析。通过两轮PCR步移反应，获得约1 000 bp的目的条带（见图1），将第2 轮PCR产物外送测序，测序结果如图2 所示。

图1 基因组步移结果

图2 步移获得的Es-IAG基因5'侧翼序列（引物用灰色背景标出，起始密码子ATG用下划线标出）

4 教学反思

4.1 摒弃固有模式，“串”零为整

无论动物、植物还是微生物，体内的生化反应都是一个复杂有序的整体，都遵循“中心法则”。因此，应该从整体水平上来看待生物化学实验课程。传统的生物化学实验课，往往都是独立的单元，割裂了各单元之间的联系。这种单元化教学模式的后果往往使学生获得的知识也呈现单元化，没有形成一个整体，进而影响了学生对生物化学理论知识的掌握，更无从谈起灵活运用生物化学实验技术。本实验项目将基因组DNA的提取、酶切连接、引物设计和PCR 反应等实验单元串联成一个整体，既考虑了实验内容和实验方法的关联性和完整性，又考虑了每个单元的相对独立性。在实验教学过程中，遵循循序渐进的原则，按照“DNA提取-酶切-链接-引物设计-PCR反应-测序”的顺序，安排实验内容。上一个实验的产物是下一个实验的原材料，环环相扣，在DNA水平将上述单元联系在一起，突出了模块教学的整体性，实现了实验内容和教学方法的有机融合。

4.2 立足发现、解决问题，开拓思维能力

生物化学实验课除了提高学生的动手能力外，培养学生的发现问题、解决问题的能力也是实验课的目标之一。在每个实验之前，指导教师都引导学生阅读相关的文献资料，做到对实验有较为清晰的理解，掌握实验的基本原理，明确不同试剂在实验中的作用。通过查阅文献使学生明确本实验与文献中技术路线有何不同，让学生带着问题走进实验室，如在DNA 提取实验中，学生的问题主要为柱式提取法与传统的酚仿的不同点；在酶切连接环节，问题为完全酶切和不完全酶切对本次实验是否有影响；在基因组步移环节，问题为基于PCR技术的基因组步移方法有哪几种；每种方法各自的优缺点是什么。所有的问题都在汇报环节集中解决，先由学生自己根据所掌握的知识给出相应的答案，如有不妥之处，由指导教师答疑释惑。因此，模块化的实验课程设置体系和循序渐进的教学方式，不但可以使学生在实验过程中变被动为主动，发挥主观能动性，逐步提高发现问题、分析问题和解决问题的能力；而且还可以增强团队意识和协作能力。

5 结语

生物化学是一门与时俱进的学科，近年来由于科技不断地发展，生物化学技术突飞猛进，特别是分子生物学技术取得了一系列的成果，如基因编辑技术-CRISPR/Cas9 系统［14-15］、核糖核酸（RNA）干扰技术［16］等。随着生物科技产业化的发展，社会对生物方面的人才需求日益增长，不仅要求具有扎实的理论基础，而且更看重毕业生的“即插即用”能力。因此，不断替换原有的实验内容，添加前沿性的实验项目将是生物化学实验课程面临的重要课题。基于此，团队根据理论知识结合生物化学发展的现状，开展了具有前沿性“基因组步移”模块实验，旨在提高学生的综合科研能力，使其所学到的知识与本领能为将来走上工作岗位奠定良好的基础。