双委夜蛾感觉神经元膜蛋白编码基因鉴定及组织表达谱分析

宋智煜，陈双臣，白小军，董钧锋，宋月芹*

(1.河南科技大学林学院，河南洛阳471000；2.宜阳县林业技术指导站，河南洛阳471600)

昆虫的化学感受系统在其生存和繁殖过程中起着极其重要的作用(Kaupp，2010；Sunetal.，2014；Zhangetal.，2015)。研究者对昆虫触角嗅觉信号传导的分子机制研究有了突出的进步：在昆虫嗅觉识别时，气味分子从触角感器孔渗入，然后被气味结合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)或化学感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)识别和转移，最后激活位于嗅觉感觉神经元(olfactory sensory neurons，OSNs)树突膜上的嗅觉受体(odorant receptors，ORs)或离子型受体(ionotropic receptors，IRs)，产生电位，指导昆虫做出相应的行为反应(Bentonetal.，2009；Leal，2013；Britoetal.，2016；de Fouchieretal.，2017；Yangetal.，2017)。此外，还有一些蛋白如感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)在昆虫气味识别过程中也扮演着至关重要的角色(Leal，2013)。

昆虫SNMPs是一种膜蛋白，与脊椎动物CD36家族为同源基因，具有2个跨膜区域，其功能主要是识别和转运亲脂性气味分子如脂肪酸和脂类化合物等(Rogersetal.，1997，2001a；Febbraio & Silverstein，2007；Levyetal.，2007；Vogtetal.，2009；Martinetal.，2011)。昆虫第一个SNMP基因被鉴定在多音蚕蛾Antheraeapolyphemus中，命名为ApolSNMP1。随后SNMP的第二个亚类型在烟草天蛾Mauducasexta中被发现，命名为MsexSNMP2(Rogersetal.，1997，2001a，2001b)。紧接着SNMP的同源基因在鳞翅目Lepidoptera(Rogersetal.，2001a，2001b；Forstneretal.，2008)、双翅目Diptera(Jinetal.，2008)、鞘翅目Coleoptera(Nichols & Vogt，2008)、直翅目Orthoptera(Vogtetal.，2009)和膜翅目Hymenoptera(Huetal.，2013)等昆虫中都有发现。SNMP基因家族一直以来被认为只有2个成员，即SNMP1和SNMP2。而昆虫SNMP家族的第三个成员SNMP3在鳞翅目中被鉴定(Zhangetal.，2018)，被认为主要与昆虫的免疫反应有关，这还需要进一步证明。

双委夜蛾Athetisdissimilis属鳞翅目夜蛾科Noctuidae委夜蛾属Athetis，近年逐渐成为小麦Triticumaestivum和玉米Zeamays地的主要害虫。外形类似于二点委夜蛾A.lepigone，食量极大，对小麦和玉米产量造成极大的威胁(王振营等，2012；郭婷婷等，2016a,2016b)，发展新型友好的杀虫剂迫在眉睫。本研究鉴定了双委夜蛾的2个SNMP基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2，并通过荧光定量PCR技术对双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析。以期为进一步探索双委夜蛾SNMPs的化学通讯功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试虫的准备

双委夜蛾来自河南科技大学林学院昆虫实验室，该群体为自2012年7月在河南省洛阳市周边玉米田诱集的成虫，在室内继代饲养至今(宋月芹等，2015)。室内饲养条件为：温度27 ℃±1 ℃，相对湿度80%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 总RNA的提取与第一链cDNA的合成

选取双委夜蛾羽化后第3天的雌雄成虫，收集触角各50头、头部各30头、胸部各20头、腹部各3头、足各30头、翅各50头，每个样品收集重复 3次。将双委夜蛾各部分组织解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL离心管内，-80 ℃保存。

总RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)试剂盒进行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)对提取的RNA进行除DNA处理。采用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)进行质量检测。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)试剂盒对RNA进行反转录。

1.3 双委夜蛾SNMPs基因的克隆

从本实验室前期对双委夜蛾触角转录组测序注释结果中(Dongetal.，2016)搜索到2个SNMP基因。根据该序列设计特异性引物，AdisSNMP1-F：5’-ATGGCGCTTCCTAAGGAGATA-3’，AdisSNMP1-R：5’-AATGTACAACTAGAACCGACC-3’；AdisSNMP2-F：5’-ATGTTGGGAAAACATTCGAAAATG-3’，AdisSNMP2-R：5’-AGTTAAGGGAAATAATTGCACTC-3’。PCR反应体系为20 μL：雌蛾触角cDNA模板1 μL，上、下游引物各1.5 μL(10 μmol·L-1)，dNTPs混合液 1.6 μL(2.5 μmol·L-1)，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(TaKaRa，大连)，10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O 12.2 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃ 10 min。胶回收目的片段，将目的片段克隆到pMDTM19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆培养过夜，送去测序。

1.4 双委夜蛾SNMPs基因的序列分析

核酸序列采用在线工具(http://www.bio-soft.net/sms/)翻译；采用在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)进行跨膜区域预测；利用在线工具(https://web.expasy.org/protparam/)对蛋白序列特性进行分析；采用在线工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白亲疏水性；采用线下DNAMAN进行多重序列比对；采用线下MEGA 6.0构建进化树。

1.5 荧光定量PCR

通过荧光定量PCR检测双委夜蛾SNMPs基因在不同组织中的表达情况。根据双委夜蛾SNMPs基因的开放阅读框和荧光定量引物设计原则设计特异性引物(5’-3’)，AdisSNMP1-F：TCCTGTTCCCTGTCATACTCAA，AdisSNMP1-R：GTGCCCTCTCCTTTAGTAACAG，AdisSNMP2-F：CTGCTCTACTAACGGTCCACGA，AdisSNMP2-R：ACGAAACCCTGACCACACGCCT。内参基因为双委夜蛾GADPH基因，引物为：AdisGADPH-F：CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC；AdisGADPH-R：TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG。

荧光定量PCR在ABI 7500 PCR仪(ABI，Carlsbad，CA，USA)上进行，每个反应体系20 μL，包括10 μL的2×SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大连)、0.8 μL的正反向引物(10 μmol·L-1)、2 μL的cDNA模板(200 ng)和6.4 μL的DEPC水。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。试验重复3次。

1.6 数据分析

所有SNMPs基因在双委夜蛾不同组织中的相对表达量为ΔCt=Ct目标基因-Ct内参基因。利用SPSS 17.0中的ANOVA方法对AdisSNMPs基因在双委夜蛾不同组织中的表达量进行差异比较(新复极差法检验，P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 双委夜蛾SNMPs基因克隆及序列特征

反转录及PCR结果(图1)显示，在1 000～2 000 bp之间有1条明显的单一条带，结果与预期大小相符。测序结果在NCBI上的同源性搜索结果表明，所测序列与多种昆虫的SNMP基因序列高度同源，证明这2个基因就是双委夜蛾的SNMP基因，分别命名为AdisSNMP1和AdisSNMP2，GenBank登录号分别为MT954936和MT954937。

M. DNA Marker DL2000, 1.AdisSNMP1, 2.AdisSNMP2

这2个SNMPs基因都具有全长的开放阅读框，AdisSNMP1长度为1 572 bp，编码523个氨基酸(图2)；而AdisSNMP2长度为1 563 bp，编码520个氨基酸(图3)。这2个基因编码蛋白质都是酸性，AdisSNMP1的等电点是5.96，蛋白分子量是59.09 kD；AdisSNMP2的等电点是5.69，蛋白分子量是58.72 kD。

双委夜蛾2个SNMPs基因的亲水性和疏水性预测发现，AdisSNMP1和AdisSNMP2在氨基酸序列的C-端和N-端跨膜区域有2个明显的疏水位点(图5)。

2.2 双委夜蛾SNMPs与其他昆虫SNMP基因的同源性及进化树分析

将双委夜蛾AdisSNMP基因与已报道的其他昆虫SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在线搜索工具进行同源性分析，发现AdisSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，如AdisSNMP1与小地老虎AgrotisipsilonAipsSNMP1序列一致性为85.69%；与斜纹夜蛾SpodopteralituraSlitSNMP1序列一致性为86.64%。AdisSNMP2与小地老虎AipsSNMP2序列一致性为86.54%；与斜纹夜蛾SlitSNMP2序列一致性为85.38%。与不同目昆虫SNMP基因一致性较低，如AdisSNMP1与烟飞虱BemisiatabaciBtabSNMP1序列一致性为33.84%；与茶翅蝽HalyomorphahalysHhalSNMP1序列一致性为37.45%。AdisSNMP2与烟飞虱BtabSNMP2序列一致性为27.27%；与茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性为25.52%。双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2序列一致性为27.05%。

使用MEGA 6.0对11种昆虫的SNMP同源基因进行进化树比较。SNMPs基因被分成2个亚组，即SNMP1和SNMP2(图6)。双委夜蛾的AdisSNMP1和AdisSNMP2基因分别被聚集到这2个亚组，并且与同为鳞翅目昆虫的小地老虎和斜纹夜蛾SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。

2.3 双委夜蛾SNMPs基因表达谱分析

使用荧光定量PCR对双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析，结果发现：AdisSNMP1和AdisSNMP2在雌雄蛾触角中高度表达，雄蛾的表达量普遍比雌蛾高。除触角外，AdisSNMP1几乎不在其他组织中表达或表达量甚微。AdisSNMP2除在触角中表达量丰富外，在足中也有少量表达(图7)。

3 讨论

本研究根据前期双委夜蛾触角转录组的数据，通过BLASTX在线搜索和同源性比较鉴定出2个SNMPs基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2。这2个基因与其他昆虫SNMPs具有类似的特征，如在氨基酸序列N端和C端附近有2个保守的跨膜区域，并且由6个保守的半胱氨酸残基形成二硫键组成一个大的胞外环，此结构也与CD36基因家族极其相似(Huangetal.，2016；Sunetal.，2019；Yangetal.，2020)。根据对这2个跨膜蛋白结构投影预测，这部分的功能是转运和结合脂类分子(Herbosoetal.，2011；Pregitzeretal.，2014)，推测双委夜蛾SNMPs的2个跨膜区具有同样的功能。

双委夜蛾AdisSNMP基因同源性搜索发现AdisSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，与不同目昆虫SNMP基因一致性较低。双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2之间序列一致性也比较低。进化树结果也显示，双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2分别被聚集到SNMP1和SNMP2，在同一组内，同为鳞翅目昆虫的SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。此结果与大多数昆虫SNMP基因特性相同(Guetal.，2013；胡颖颖等，2013；Yangetal.，2020)。在鳞翅目中曾经鉴定出SNMP3亚家族基因(Zhangetal.，2018)，而在双委夜蛾触角转录组数据中没有发现该基因，可能是这个基因在幼虫肠中高度表达的原因。

组织特异性表达可以为功能预测提供可靠性的参考。本研究发现双委夜蛾SNMP1主要表达在雌雄蛾的触角中，此结果与多音蚕蛾(Rogersetal.，1997)、脐橙螟Amyeloistransitella(Lealetal.，2009)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Liuetal.，2014)等多种昆虫SNMP1的表达模式相同。Benton等(2007)在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中发现，DmelSNMP1能够识别集合信息素cVA，激活受体HR13。Pregitzer等(2014)在烟芽夜蛾Heliothisvirescens中也发现，HvirSNMP1能明显增强HR13对信息素Z11-16:Ald的结合力。以上研究都暗示昆虫SNMP1的功能是调节信息素的识别和通过SNMP-OR互作转运信息素。相对于AdisSNMP1，AdisSNMP2的表达相对广泛，除嗅觉感器触角外，在非嗅觉感器足中也有少量表达，此结果与小菜蛾Plutellaxylostella(Li & Qin，2011)、二化螟Chilosuppressalis(Liuetal.，2013a)、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis(Liuetal.，2013b)和甜菜夜蛾(Liuetal.，2014)一致。昆虫身体上分布有大量的味觉感器(Montell，2009)，而CD36蛋白的主要功能是转运脂类化合物，因此可推测AdisSNMP2和GRs在这些组织中共同表达，识别脂类分子完成味觉过程。

本研究通过前期双委夜蛾触角转录组数据鉴定出 2个SNMPs基因，并且研究了这些基因在双委夜蛾不同组织中的表达情况，不仅丰富了昆虫SNMPs基因的数量，也为今后对双委夜蛾SNMPs基因功能的研究提供参考。