日粮精粗比对育肥藏羊瘤胃组织形态及微生物菌群的影响

李蒋伟，王志有，侯生珍，雷云，贾建磊，周力，桂林生

（青海大学农牧学院，青海西宁810016）

反刍动物瘤胃内微生物主要由细菌、原虫和厌氧真菌以及少量的噬菌体组成，其中细菌的种类和数量最高，根据功能差异可分为纤维降解菌、蛋白质降解菌、脂肪降解菌、半纤维素降解菌、乳酸菌和淀粉降解菌，在瘤胃各项功能中扮演着重要角色［1］。瘤胃中，不同种类菌群之间都处于动态平衡，它们互相依存又互相制约。宿主为瘤胃微生物提供适宜的生存环境，同时为其增殖提供必要的营养成分；而瘤胃微生物能够消化宿主无法利用的植物性饲料，由此可见宿主与瘤胃微生物之间属于共生关系［2］。

反刍动物瘤胃微生物区系的变化受诸多因素的影响，如动物年龄、品种、饲料、健康状况等，其中日粮组成对其影响最为显著。反刍动物对粗饲料的需求很大，粗饲料中含有大量的纤维素，这些纤维物质主要靠瘤胃细菌中纤维降解菌的作用分解消化［3］。在高粗饲料日粮的饲喂下，反刍动物瘤胃中优势菌群为革兰氏阴性菌，纤维素分解菌中白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌最具优势，随日粮精料的添加，革兰氏阴性菌的数量逐渐降低，革兰氏阳性菌的比例渐渐升高［4］。Mackie 等［5］利用选择性培养基滚管计数得到低精料日粮饲喂下，淀粉分解菌的比例为1.6%，乳酸利用菌比例为20%，当迅速转为高精料时，淀粉分解菌增加到21.2%，乳酸利用菌比例上升到22.3%，由此现象可知，淀粉分解菌受日粮影响显著，而乳酸利用菌相对不明显。王海荣［6］发现日粮精粗比对真菌数量影响差异不显著，随精粗比例增加纤毛虫数量增加。

16S rDNA 高通量测序技术利用其在不同菌种中序列的多样性进而鉴定菌种的类别［7］，而使用高通量测序技术测定不同精粗比日粮对藏羊瘤胃组织形态及微生物菌群分布鲜有报道。本试验旨在探究早期断奶藏羔羊育肥期日粮适宜的精粗配比，测定藏羊瘤胃组织形态的变化规律和微生物分布特征，分析不同精粗比日粮对育肥藏羊瘤胃发育及菌群定植的影响，为藏羊日粮的合理配制和科学饲养提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

2019 年5 月15 日-8 月25 日，在青海省海南州共和县切吉乡哇合村青海香咔梅朵牧业有限公司进行动物饲养试验；2019 年9 月16 日瘤胃样品交由百迈克生物科技公司进行瘤胃微生物16S rDNA 基因的测序工作。

1.2 试验设计及饲养管理

选择健康、体况相近的早期断奶藏羊母羔共 210 只［（22.18±1.03）kg］，随机分成 7 组，每组 30 只。7 组羔羊分别饲喂精粗比为 20∶80（A 组）、30∶70（B 组）、40∶60（C 组）、50∶50（D 组）、60∶40（E 组）、70∶30（F 组）和 80∶20（G组）的日粮；日粮精粗比为干物质比，各组精饲料完全一致，粗饲料由燕麦（Avena sativa）青干草与燕麦青贮按干物质比例1∶1 混合而成。饲养试验预饲期为10 d，正试期为90 d。因藏羊未有现行饲养标准，故参考NY/T 816-2004 中国肉羊饲养标准［8］进行日粮配制，精饲料组成及营养水平如表1。

表1 精饲料组成及营养水平Table 1 Composition and nutrition level of refined feed（%）

1.3 饲养管理

试验羔羊全舍饲分栏饲养，分别于早晨8：30 和下午16：30 饲喂羔羊两次，日粮自由采食，自由饮水，每天饲喂前清扫残留饲料并称重。每天中午12：30 定期清扫羊舍，保持羊舍卫生、通风和干燥，每周对羊舍和运动场进行两次消毒杀菌。试验期对羔羊进行羊四联、小反刍兽、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分别用伊维菌素和溴氰菊酯淋浴进行内外寄生虫防治。

1.4 样品采集和处理

饲养试验结束后，每组中随机抽取3 只羔羊于清晨空腹屠宰，采集瘤胃背囊组织5 cm2，投入10%甲醛溶液固定；在不同位点取瘤胃液于50 mL 离心管中，混匀、过滤后将滤液3500 r·min-1离心15 min，投入液氮，于实验室-80 ℃冷冻保存。

1.5 瘤胃组织分析方法

从采集的瘤胃组织中取材，经30%葡萄糖溶液脱水24 h，OCT 包埋剂包埋后用低温恒温冷冻切片机（25 mL香柏油中性树胶，上海）进行冷冻，切10 μm 厚度切片，于阴凉干燥处晾干24 h，用苏木精-伊红（hematoxylin-eo⁃sin，HE）染色，完成后用中性树胶固封，于阴凉干燥处晾干24 h，制成组织切片。以OlympusCX51 显微镜（日本）、OlympusDP21 图像采集和Image-Pro Plus 5.1 图像分析系统观察测量瘤胃角化层、肌肉层厚度，乳头长度、宽度及密度。

1.6 瘤胃液细菌微生物分析方法

本试验16S rDNA 高通量测序部分交由百迈客生物科技有限公司测定，对采集到的21 个瘤胃液样品基于Il⁃lumina HiSeq 测序平台，采用双末端测序（Paired-End）的方法，构建小片段文库进行测序，进一步对Reads 拼接过滤，OTUs 聚类分析，物种注释及丰度分析。使用DNA 提取试剂盒（Invitrogen™，USA）提取瘤胃微生物基因组DNA，根据保守区设计得到引物，其中通用引物正向：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向：3′-GGAC⁃TACHVGGGTATCTAAT-5′。在引物末端加上测序接头，进行PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库进行高通量测序，进而得到原始图像数据文件。PCR 扩增步骤为：模板 DNA 经加热至 98 ℃左右持续 2 min，轮回 30 次循环，依次经过 98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延长7 min。

1.7 数据处理

采用Excel 整理初始数据，用SPSS 20.0 中的One-way ANOVA 进行单因素方差分析，检测结果用平均值±标准误（mean±SE）的形式表示。差异显著的评断标准为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 日粮精粗比对藏羊瘤胃组织形态的影响

D 组瘤胃角化层（除B 组外）和乳头密度均显著高于其余各组（P＜0.05）；B 组瘤胃肌肉层显著高于（除C、E组外）其余各组（P＜0.05）；B 组乳头高度显著低于 E 和 G 组（P＜0.05），F、G 组乳头宽度显著高于 A、C、D 组（P＜0.05）（表2）。图1 展示了各组瘤胃组织的切片显微结果。

表2 日粮精粗比对藏羊瘤胃组织形态的影响Table 2 Effect of dietary concentrate to forage ratio on rumen morphology of Tibetan sheep

图1 日粮精粗比对藏羊瘤胃组织形态的影响Fig.1 Effect of dietary concentrate to forage ratio on rumen morphology of Tibetan sheep（40×）

2.2 日粮精粗比对早期断奶藏羔羊瘤胃细菌微生物的影响

2.2.1 测序数据质量评估 由表3 可知，参与测序样品共产生1057550 条Clean tags，每个样品至少产生40189 条 Clean tags，平均产生 50360 条 Clean tags，质控有效数据量达47991。所有样品测序覆盖率均在99%以上，本试验测序深度能够准确反映瘤胃细菌的组成。

2.2.2 不同精粗比日粮对羔羊瘤胃细菌多样性的影响 从图2 可以看出，在97%的物种相似度水平下，7 组检测样本共得到 299 个 OTUs，其中有 259 个为 7 组共有OTUs，占 OTUs 总数的86.6%，独有的OTUs 分别为 0、10、1、1、6、14 和 8 个，占 OTUs 总数的比例较小，表明各组OTUs 组成差异很小，相似度较高；其中F 组瘤胃细菌特有OTUs 最高，总共有273 个OTUs，B 组次之，OTUs 共 269 个，A 组 OTUs 最少为259 个。

Rank-abundance 曲线可解释7 组样品多样性的丰富程度和均匀程度，在横轴上的宽度代表物种丰富程度，曲线的形状则表示物种的均匀程度，曲线平坦，表示样品中瘤胃微生物均匀度较高。图3 中，每条曲线对应一个样品，用不同颜色标记。可以看出：随着精粗比例的增加，曲线宽度逐渐增加，即随着日粮精粗比例的升高，瘤胃微生物菌群组成丰度逐渐增加；且图中曲线都较平坦，其中D 组曲线波动较大。

Alpha 多样性分析可以反映测定样品瘤胃微生物群落丰富度和多样性，其中Chaol 指数和ACE 指数越大表明群落丰富度越大；Simpson 指数越大反映群落多样性越低；Shannon 指数越大群落多样性越高。由表 4 可知，Shannon 指数，A、B、C 组间无显著性差异（P＞0.05），但均显著低于其余各组（P＜0.05），F 组最高；Simpson 指数，E、F 组无显著性差异（P＞0.05），但均显著低于A 和 C 组（P＜0.05），A 组最高（P＜0.05）；Ace 指数和Chao1 指数，F 组均显著高于A、B、C、D 组（P＜0.05）。

表3 测序质量Table 3 Sequencing quality

图2 OTUs 花瓣图Fig.2 Petals of OTUs

图3 Rank-abundance 曲线Fig.3 Rank-abundance curve

表4 阿尔法多样性指数Table 4 Alpha diversity index

2.3 不同精粗比日粮对羔羊瘤胃细菌分布的影响

2.3.1 门水平下瘤胃细菌分布分析 对门水平下丰度较高的5 种细菌进行显著性分析如表5 所示。A、B、C、D 组的优势菌群都是Firmicutes（厚壁菌门），丰度分别为85%、79%、75%、39%；E 组优势菌群为Bacteroidetes（拟杆菌门），丰度为36%；F 和G 组优势菌群均为Proteobacteria（变形菌门），丰度分别为51%和34%。Firmicutes（厚壁菌门）：A 组显著高于 D、E、F、G 组（P＜0.05），但与 B、C 组差异不显著（P＞0.05）；F 组 Acidobacteria（酸杆菌门）显著高于A、B、C 组（P＜0.05）；Proteobacteria（变形菌门）F 组显著高于A、B、C、D、E 组（P＜0.05），但与G组差异不显著（P＞0.05）。

表5 门水平下细菌相对含量Table 5 Relative content of bacterial at phylum level

2.3.2 科水平下瘤胃细菌分布分析 对科水平下丰度较高的5 种细菌进行显著性分析，从表6 可以看出，A 和B 组优势菌群均为Lachnospiraceae（毛螺菌科），丰度分别是30%、28%；C 组优势菌群为Ruminococcaceae（瘤胃球菌科），丰度大于22%，且Ruminococcaceae（瘤胃球菌科）在各精粗比日粮饲喂下无明显差异；D 组优势菌群Veillonellaceae（韦荣氏球菌科），丰度为16%；E 组优势菌群为Prevotellaceae（普雷沃氏菌科），丰度为16%；F 组优势菌群为Prevotellaceae（普雷沃氏菌科），丰度大于1%；G 组优势菌群为Christensenellaceae（克里斯滕森菌科），丰度大于 8%。Lachnospiraceae（毛螺菌科）A 组显著高于 D、E、F、G 组（P＜0.05），与 B 和 C 组差异不显著（P＞0.05）；Christensenellaceae（克里斯滕森菌科），B 与 C 组差异不显著（P＞0.05），但显著高于其余各组（P＜0.05）。

表6 科水平下细菌相对含量Table 6 Relative content of bacterial at family level

2.4 KEGG 分析

根据KEGG 分类柱状图（图4）可得出，7 组羔羊瘤胃细菌共有25 个基因功能家族，占比在前5 的瘤胃细菌的功能，7 组均集中在一般功能基因（11%以上）、碳水化合物运输和代谢（9%以上）、氨基酸运输和代谢（7.8%以上）、转录（7.3%以上）、复制重组与修复（5.2%以上）上。且在碳水化合物运输和代谢以及转录类细菌随着精粗比的递增有减小的趋势；关于氨基酸运输与代谢类细菌与日粮精粗比呈正相关；其余3 类功能细菌含量各处理组间无较大差异。F 组细菌功能在细胞活性、能源生产和转换、脂质运输和代谢及总体功能上表现相较各试验组均为最高，在细胞周期控制、细胞分裂、染色体分区、翻译、核糖体结构和生物转化等方面功能细菌含量较少。

图4 KEGG 功能注释图Fig.4 KEGG function annotation diagram

3 讨论

3.1 日粮精粗比对藏羔羊瘤胃组织形态的影响

瘤胃是反刍动物断奶后机体营养物质主要消化场所，其内环境的稳定平衡是藏羔羊生产潜力发挥和生产性能提高的重要基础。Suárez 等［9］研究发现，日粮中粗饲料能有效降低瘤胃乳头结块并缓解瘤胃黏膜发育不良，表明适宜的精粗比和优质的粗饲料可维持瘤胃乳头正常形态。本试验结果表明，随着精饲料比例增加，瘤胃乳头长度和宽度有增加趋势，但瘤胃乳头密度显著降低；精粗比例的变化使角化层和肌肉层产生显著差异，说明粗饲料具有粗糙性和研磨值，其高粗纤维含量日粮对瘤胃具有物理刺激作用，一定程度上能够增加瘤胃蠕动，同时促进肌层发育，且适宜的粗饲料可对瘤胃角化层的消磨及死亡上皮细胞的清除有积极作用，保证瘤胃上皮的完整性。本试验结果符合上述规律，但粗饲料体积较大和精粗比例过低使饲料适口性受到影响，进而影响采食量，导致羔羊摄取营养水平降低，对瘤胃组织发育造成负面影响。

3.2 日粮精粗比对藏羔羊瘤胃微生物丰度的影响

日粮类型、结构及饲喂方式能够显著影响反刍动物瘤胃微生物种类与数量［10］。曾钰等［11］研究发现，在舍饲牦牛饲料中添加酵母培养物会影响瘤胃细菌的丰富度，但是对细菌多样性没有影响。占今舜等［12］研究日粮精粗比对湖羊瘤胃发酵和菌群结构的影响后发现，高精粗比日粮对湖羊瘤胃细菌丰富度和多样性及瘤胃的发酵具有促进作用。本研究发现，不同精粗比饲喂下各处理组之间OTUs 组成无较大差异，但随着日粮精粗比例的增加瘤胃菌群的多样性有升高的趋势，其菌群物种丰富度和均匀度也有变高的趋势；且精粗比例为70∶30 的处理组细菌丰度和均匀度以及物种多样性表现较好，与上述研究结果相似。日粮结构是影响瘤胃微生物数量、丰度等的重要因素之一，而精粗比例是日粮构成的基础要素，适当的精粗比，能够提高反刍动物消化代谢功能，优化瘤胃内环境，有效提高饲料利用率［13］。当前，藏羊的养殖方式从传统的放牧饲养+补饲到全舍饲养殖，其逐渐适应了全舍饲养殖模式，且一定比例的精粗饲料混合饲喂可使瘤胃微生物的生长分布表现最佳，有效缩短了藏羊的育肥周期，降低了草场季节性变化带来饲草资源短缺的影响。

3.3 日粮精粗比对藏羔羊瘤胃微生物物种分布的影响

门水平下，藏羊瘤胃细菌优势菌群为厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门，与在牛、鹿以及山羊上的研究结果一致［14-16］。此外，日粮精料比例的降低有提高厚壁菌门相对丰度的趋势，精粗比例小于60∶40 时，各试验组瘤胃中的优菌群均为厚壁菌门。前期，诸多研究证实，日粮的类型和组成对瘤胃中厚壁菌门具有一定程度的影响。李永洙等［17］发现早期饲喂代乳粉能够导致羔羊瘤胃中优势菌群由厚壁菌门变为拟杆菌门。以陕北绒山羊为研究目标，韩旭峰［18］证实，高精料组瘤胃中厚壁菌门的相对丰度显著低于低精料日粮组。据研究，厚壁菌门多为革兰氏阳性菌，其在反刍动物消化道微生物群落中广泛分布，是促进纤维分解的主要菌门，可将纤维降解为反刍动物可利用的短链脂肪酸以供宿主使用，所以厚壁菌门在瘤胃微生物中的群落分布理论上与粗饲料比例呈正相关。科水平下，20∶80 组（A 组）的毛螺菌显著高于 50∶50、60∶40、70∶30 和 80∶20 组（D、E、F 和 G 组）。与瘤胃球菌功能相似，毛螺菌能够吸附并破除饲料中植物细胞壁，从而有效降解纤维素为单糖和短链脂肪酸。Wang 等［19］和Heinritz等［20］证实，日粮中精料能够显著降低荷斯坦奶牛瘤胃细菌中毛螺菌的相对丰度，本研究结果与其一致。结合毛螺菌的功能，本研究推测粗纤维构成的日粮能够为毛螺菌提供更多且更有效的结合基质，进而促进其增殖。Kim等［21］研究认为，随日粮精粗比例升高，普雷沃氏菌科呈显著增多的趋势。张洁等［22］表示普雷沃氏菌丰度与日粮蛋白质水平呈正相关。普雷沃氏菌科被认为是一种多糖降解菌属，有助于降解黏蛋白和植物碳水化合物，尽管无法直接降解纤维素，但可以通过共培体系与纤维降解菌利用木聚糖和果胶［23］，本试验证实适量的精料可促进普雷沃氏菌科生长，精粗比在60∶40（E 组）时普雷沃氏菌科相对丰度最高，可能是因为高精料日粮含有大量的低聚果糖和淀粉物质需要被消化，相应促进普雷沃氏菌科的比例。但过高精料比例日粮则会导致瘤胃pH 值下降，反而抑制该菌的生长。

3.4 日粮精粗比对藏羔羊瘤胃微生物细菌功能的影响

瘤胃微生物菌群是一种微生物共生联合体，微生物和宿主之间、微生物与微生物之间保持着相互依赖、相互制约的关系。掌握瘤胃代谢与微生物相互之间的关系，能够为藏羊日粮的科学设计提供理论依据。通过对藏羔羊瘤胃微生物菌群进行KEGG 通路的功能性注释后得出，功能通路主要富集于通用功能预测、转录、碳水化合物代谢和氨基酸运输和代谢。本试验发现随着日粮中精料比例的增加，有促进氨基酸的运输与代谢与能源生产和转换通路富集的趋势。结合这2 个通路的功能，即调控蛋白合成和能量代谢。本研究推测，精料能够为瘤胃微生物的增殖提供更为丰富的营养物质，促进对应功能的微生物菌落的相对丰度，如拟杆菌和普雷沃氏菌等，进而体现在相关通路富集的差异性上。

4 结论

在本试验条件下，当日粮精粗比例为50∶50 时，早期断奶藏羔羊育肥过程中瘤胃乳头、角化层发育较好；精粗比为70∶30 时瘤胃微生物多样性及丰富度较好；日粮精料比例的降低有提高厚壁菌门相对丰度的趋势；适量的精料可促进普雷沃氏菌科生长，精粗比在60∶40 时普雷沃氏菌科相对丰度最高，但过高的精粗比例会抑制该菌生长。综合上述结果，精粗比为70∶30 时更适合藏羔羊短期育肥。