加味柴芍六君颗粒对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜屏障及MEK-ERK-MLCK通路的影响

陈龙开 万星阳 罗绪 周泠 黄海舸

(1遵义医科大学附属医院中医科，贵州 遵义 563000；2中山大学附属第六医院中西医结合肛肠科；3右江民族医学院附属医院胃肠外科)

溃疡性结肠炎(UC)是由结直肠的慢性非特异性炎症反应引起的常见疑难病〔1〕。目前西医尚无有效的治疗方法，而中医认为肝郁脾虚会引起溃疡性结肠炎，加味柴芍六君颗粒具有疏肝解郁、理气健脾之功效，预计可治疗溃疡性结肠炎〔2〕。肌球蛋白轻链激酶(MLCK)，是一种钙调素(CaM)依赖酶，可以介导构成肠黏膜上皮细胞机械屏障的关键结构即紧密连接(TJ)的通透性动态调节过程，进而调控肠黏膜通透性，肠黏膜通透性增加是UC的主要病理改变〔3～5〕。MLCK主要由丝裂原活化蛋白激酶激酶-细胞外调节蛋白激酶(MEK-ERK)信号激活，MEK激活ERK并使之磷酸化，p-ERK转移到核内与 MLCK结合，进而磷酸化并激活MLCK，最终影响肠黏膜屏障的通透性〔6〕。目前加味柴芍六君颗粒是否能治疗UC及其分子机制还不清楚，本研究通过观察加味柴芍六君颗粒对大鼠肠黏膜屏障及MEK-ERK-MLCK通路的影响，以探讨加味柴芍六君颗粒对UC的疗效及其可能药理机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF清洁级SD雄性大鼠60只，体重为180～220 g，由遵义医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证：SCXK(贵)2017-0013，动物合格证号：0000623，饲养条件为：温度为25℃，湿度为50%，噪音低于85 dB，每小时通风换气8～12次。

1.2实验药品、试剂及仪器 加味柴芍六君颗粒(主要药物成分：柴胡10 g，白芍 15 g，陈皮 6 g，制半夏 10 g，太子参 15 g，茯苓 15 g，炒白术 15 g，甘草 6 g，白花蛇舌草 20 g，三七10 g，风尾草 20 g)购自江苏省江阴市天江药业有限公司；TNBS(批号89168-064)购自Amresco 公司；髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒(批号YM-SX1873)购自上海远慕生物科技有限公司；RNAiso Plus(批号9108)、逆转录试剂盒(批号RR037Q/A/B)、荧光定量PCR试剂盒(批号639519)购自日本Takara公司；MEK、ERK、MLCK、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔源GAPDH抗体(批号ab181602)、MEK抗体(批号ab96379)、ERK抗体(批号ab32537)、p-ERK抗体(批号ab192591)、MLCK抗体(批号ab232949)、p-MLCK(批号ab200809)，羊抗兔二抗(批号ab150077)，购自Abcam公司；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(批号C0105)、蛋白提取试剂盒(批号P0027)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(批号P0011)、EP管、移液枪枪头购自上海碧云天生物技术有限公司。Elx800酶标仪购自美国Bio-Rad公司；制冰机、恒温水浴锅购自北京六一仪器厂；光学显微镜购自日本尼康公司；荧光定量PCR仪、台式高通量DNA合成仪购自Thermo公司；垂直电泳仪及转移系统、射线摄影暗厘，均购自广州艺佳生物。

1.3方法

1.3.1动物模型制备及给药方法 60只SD雄性大鼠随机分为对照组，模型组，加味柴芍六君颗粒低(0.25 g/ml)、中(0.50 g/ml)、高剂量(1.00 g/ml)组，根据文献用药量换算到大鼠将加味柴芍六君颗粒配制成浓度为0.25 g/ml、0.50 g/ml、1.00 g/ml的溶液〔7〕。根据文献按以下方法造模：除对照组正常照常饮食，其余各组禁食24 h后腹腔麻醉，将一直径2.0 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm，缓慢注入TNBS乙醇溶液，剂量为100 mg/kg，给药完毕，缓慢拔出塑胶管，提起大鼠尾部，持续倒置5 min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内，待其自然苏醒，常规饲养〔8〕。大鼠出现腹泻、黏液脓血便后，造模成功，然后加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量治疗组每天单位体重给以相同体积的剂量(10 ml/kg)灌胃治疗，连续5 w，模型组和对照组以等剂量的生理盐水灌胃，持续5 w。

1.3.2大鼠疾病活动指数(DAI)评分及标本采集 药物治疗后，观察各组大鼠体重变化、大便性状、便血情况进行DAI评分，评分标准如表1〔9〕。

表1 DAI评分标准

各组大鼠末次给药后，禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液全麻后处死，解剖分离大鼠结肠组织，以0.9%的氯化钠溶液冲洗结肠内外，洁净后滤纸吸干多余溶液-80℃冻存或者将结肠剪切为约1 cm的长度，4% 多聚甲醛中固定后，分别浸入低浓度到高浓度酒精中脱去组织中的水分，再浸入透明剂二甲苯中透明，然后石蜡包埋，进行常规病理切片做HE染色。

1.3.3HE染色实验1.3.2中的切片用二甲苯脱去石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后浸入蒸馏水后进行染色。步骤是：①以苏木素水溶液中染色5 min。②在酸水及氨水中分色，30～40 s。③流动蒸馏水冲洗1 h后浸泡片刻。④浸入70%和90%酒精中各脱水10 min。⑤以酒精伊红染色液染色约2 min。最终切片经纯酒精脱水、二甲苯透明，盖上盖玻片封固后在光学显微镜下观察。

1.3.4大鼠结肠组织学评分(HI)1.3.2中的结肠组织清洗干净后肉眼观察结合HE染色的切片镜下观察结果，根据结肠黏膜的充血、水肿、溃疡和糜烂等病理改变情况，进行HI评分，评分标准〔10〕：无损伤0分，黏膜充血、水肿、未出现溃疡1分，黏膜充血、水肿、轻度糜烂，无溃疡2分，黏膜充血、水肿、中度糜烂，有单个溃疡3分，黏膜充血、水肿、高度糜烂，有多处溃疡4分，黏膜充血、水肿、重度糜烂，溃疡>1 cm 5分。

1.3.5大鼠结肠组织MPO检测1.3.2中的冻存组织剪碎，用MPO检测试剂盒中的试剂制备组织匀浆，并严格按试剂盒的检测步骤进行检测。

1.3.6RT-PCR法检测结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA表达1.3.2中的冻存组织剪碎，参照RNAiso Plus的说明书的步骤提取总RNA，按照逆转录试剂盒的操作步骤将其逆转录为cDNA，RT-PCR引物序列：MEK正义链：AGTCTCGGAGGATGTTGG、反义链：TTGAAGGCTTACGGTGCT，133 bp；ERK正义链：CTAAACCACATCGGGAACCT、反义链：TACTTCCGGGCTTTGATGGA，188 bp；MLCK正义链：CCTGAGGAGAACAAGGAGCA、反义链：TTCTGGCTCTCTTCCCACAG，113 bp；GADPH正义链：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA、反义链：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG，130 bp。反应体系为20 μl：2×SYBR Mix10 μl，RNase Free dH2O 8 μl,上下游引物各0.5 μl,10×cDNA模板1 μl。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s、60℃退火30 s，72℃延伸60 s，40个循环。以GADPH为内参基因，根据2-ΔΔCt算法对各组mRNA表达量进行分析。

1.3.7Western印迹检测结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白的表达1.3.2中的冻存组织剪碎，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，按照BCA试剂盒的说明测定蛋白浓度，根据测定结果调整所有蛋白样本为相同浓度，然后将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，湿转全部转移至硝酸纤维膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，截取MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK、GAPDH蛋白条带，分别加入相应的抗体4℃孵育过夜，TBST溶液洗膜后室温孵育对应的二抗2 h，TBST清洗后ECL显色曝光得到蛋白条带，观察并分析蛋白的相对表达量。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1加味柴芍六君颗粒对HI评分的影响 与对照组相比，模型组大鼠结肠组织黏膜充血、水肿、糜烂，出现溃疡，HI明显升高(P<0.05)；与模型组相比，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组大鼠结肠组织黏膜充血、水肿、糜烂等病理症状均好转，HI评分明显下降且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1、2，表2。

A：对照组；B：模型组；C：加味柴芍六君颗粒低剂量组；D：加味柴芍六君颗粒中剂量组；E：加味柴芍六君颗粒高剂量组，下图同图1 肉眼观察各组大鼠结肠组织的形态

图2 镜下观察各组大鼠结肠组织HE染色的结果(×100)

表2 加味柴芍六君颗粒对DAI评分的影响分，n=12)

2.2加味柴芍六君颗粒对DAI评分的影响 与对照组相比，模型组大鼠DAI评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组DAI评分均下降且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

2.3加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中MPO的影响 与对照组〔(0.20±0.07)U/g〕相比，模型组大鼠结肠组织中MPO活性明显升高〔(0.43±0.08)U/g，P<0.05〕；与模型组相比，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组大鼠结肠组织中MPO活性均明显下降且呈剂量依赖性〔(0.32±0.05)U/g、(0.28±0.06)U/g、(0.22±0.03)U/g，P<0.05〕。

2.4加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA的影响 与对照组相比，模型组大鼠结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组大鼠结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA表达明显降低呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA表达的影响

2.5加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达的影响 与对照组相比，模型组结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组相比，加味柴芍六君颗粒低、中、高剂量组结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达明显降低，呈剂量依赖性(P<0.05)。见表4、图3。

表4 加味柴芍六君颗粒对大鼠结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达的影响

图3 Western印迹法检测结肠组织中MEK、ERK、p-ERK、MLCK、p-MLCK蛋白表达

3 讨 论

UC是一种发生于结直肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎性疾病，主要病理表现为结直肠组织黏膜充血、水肿、糜烂，出现溃疡，病灶在组织中连续分布，患者主要表现出腹痛、腹泻、黏液脓血便等症状〔11〕。西药治疗UC主要以抗炎抗免疫治疗为主，常用的药物为糖皮质激素、类固醇激素、水杨酸制剂及免疫抑制剂等，临床疗效尚可，但病情容易复发，长期服用以上药物有严重的副作用〔12〕。中医认为UC患者肝脾不和是关键，以脾虚为本，湿热、肝郁、血疲为标，整体表现为气滞血瘀，加味柴芍六君颗粒疏肝解郁、理气健脾，起活血祛瘀之功，预计可用来治疗UC。本文结果说明UC大鼠结肠组织发生炎症反应，出现黏膜充血、水肿、糜烂等病理症状，加味柴芍六君颗粒可以降低UC大鼠结肠组织的炎症反应，改善结肠组织黏膜充血、水肿、糜烂等病理症状，降低DAI、HI评分及MPO活性，揭示加味柴芍六君颗粒可以治疗UC，且疗效较好。

肠黏膜屏障是由肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等组成的机械屏障。UC患者大都肠黏膜屏障损害加重，是感染和启动肠道炎症的关键环节〔13〕。MLCK磷酸化信号通路通过介导TJ功能调控肠黏膜屏障〔14〕。MLCK是一种蛋白激酶，依赖于Ca2+/CaM〔15〕。Ca2+/CaM复合体结合MLCK，使其磷酸化激活形成p-MLCK，p-MLCK磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)的Ser19和Thr18位点，改变MLC 的空间构象，引起肌动蛋白及肌球蛋白丝收缩，使结直肠黏膜上皮细胞的TJ开放，调节上皮细胞黏膜通透性，因此，MLCK在肠黏膜屏障的损伤与修复过程中有重要作用〔16,17〕。研究表明，抑制MLCK可以下调其磷酸化水平，修复肠黏膜屏障并恢复其功能〔18〕。MEK-ERK信号通路可以通过调控MLCK的磷酸化影响上皮细胞的TJ功能，进而调控黏膜的通透性〔19〕。本文结果说明UC大鼠结肠组织中MEK-ERK-MLCK信号激活，各信号因子表达上调，加味柴芍六君颗粒可以抑制MEK-ERK-MLCK信号，下调各信号因子表达，表明加味柴芍六君颗粒可能是通过调节MEK-ERK-MLCK信号通路治疗UC。