YY1 通过下调长链非编码RNA SOX2OT 抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭

汪冬艳，张静静

1南京医科大学第一附属医院普外科，江苏 南京 210029；2南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏省中西医结合医院普外科，江苏 南京 210028

转录因子YY1是锌指蛋白家族中的一员，参与了许多生物学和生理过程，包括胚胎发生、细胞增殖、DNA复制和分化等［1-3］。本课题组先前研究表明YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用［4-5］。染色质免疫共沉淀⁃ 测序（chromatin immunoprecipitation high ⁃throughput sequencing，ChIP⁃seq）结果表明YY1可以直接与长链非编码RNA SOX2OT的启动子区结合［6］，表明YY1 可能调控SOX2OT 的转录，SOX2OT 可能参与胰腺癌的发生和进展。本研究以人胰腺癌细胞株BXPC⁃3 和PANC⁃1 为研究对象，探讨YY1/SOX2OT 轴在胰腺癌细胞迁移和侵袭中的作用，为YY1作为胰腺癌早期诊断、预后及治疗的靶标提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株BXPC⁃3 和PANC⁃1 购于上海细胞所；YY1过表达及YY1干扰的稳转细胞株由本实验室构建及保存［4］；PBS、胰酶、DMEM 高糖培养基、胎牛血清（Wisent 公司，加拿大）；双抗（青、链霉素）、RIPA 细胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、GAPDH 抗体、二抗（上海碧云天）；TRIzol、Lipofectamine 3000 转染试剂（Invitrogen 公司，美国）；反转录试剂盒、SYBR green master mix、蛋白Marker（Bio⁃Rad公司，美国）；PVDF膜、ECL试剂盒、Transwell 小室（Millipore 公司，美国）；Matrigel 基质胶（BD公司，美国）；细胞培养耗材（Corning公司，美国）；YY1抗体（Abcam公司，美国）；其他常用试剂均为国产分析纯；引物由上海吉玛设计合成；siRNA片段由广州锐博设计合成；定量PCR 仪为美国ABI Stepone plus 型号；倒置荧光显微镜为美国Nikon Ti⁃E 型；成像分析系统为美国Protein simple Fluo⁃rchem 型。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BXPC⁃3 和PANC⁃1 细胞使用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 mg/mL链霉素的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养，待细胞融合率为70%左右时，以0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸消化、传代。

1.2.2 定量RT⁃PCR

使用TRIzol试剂抽提细胞总RNA。分光光度法测定浓度后，根据说明，使用1 μg 总RNA 和iscript cDNA 合成试剂盒在20 μL 的最终体积中进行逆转录（RT）。采用SYBR green master mix 在定量PCR仪中进行定量PCR。采用2-ΔCt法，即用YY1/SOX2OT（靶基因）的Ct 值减去GAPDH（内参基因）的Ct值，计算相对基因表达量。每一个定量PCR均设置3 个复孔，独立重复3 次。YY1 上游引物：5′⁃CTTTTCACTGGACTTCAATTTGCG⁃3′；下游引物：5′⁃CACTGGTTGTTTTTGGCCTTAGC⁃3′；SOX2OT 上游引物：5′⁃AGACAGCTCTGTTCAGTATT⁃3′；下游引物：5′⁃TTACACCAGCCTCCAAGA⁃3′；GAPDH 上游引物：5′⁃ACGGGAAGCTTGTCATCAAT⁃3′；下游引物：5′⁃TGGACTCCACGACGTACTCA⁃3′。

1.2.3 Western blot

使用RIPA 细胞裂解液抽提细胞总蛋白，并用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。蛋白加1 ×SDS 上样缓冲液后于100 ℃水浴5 min，取20 μg 进行SDS⁃PAGE 电泳，而后把蛋白质转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入1∶1 000 一抗，4 ℃过夜，TBST 洗涤3 次，加二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，TBST洗3次，然后用ECL化学发光试剂于暗室自显影。用成像分析系统拍照记录并进行灰度分析。

1.2.4 细胞划痕实验

先用记号笔在6 孔板背面划横线，每隔0.5～1.0 cm一道，横穿过孔；每孔至少穿过5条线。在孔中加入5×105个细胞。第2 天用枪头垂至于背后的横线划痕。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37 ℃、5%CO2培养箱培养。按0 h、24 h时间点取样，拍照。

1.2.5 Transwell细胞侵袭实验

将Matrigel 1∶8稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 ℃30 min，使Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。细胞撤血清饥饿12 h后，消化细胞，调整细胞密度至5×105个/mL，取细胞悬液100 μL 加入Transwell 小室。24 孔板下室加入600 μL含20%胎牛血清的培养基，放入37 ℃5%CO2培养箱培养24 h。随后取出Transwell 小室，弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定30 min，将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未侵入细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随机5个视野观察细胞，记数。

1.2.6 SOX2OT过表达慢病毒及稳转细胞株构建

SOX2OT过表达慢病毒及其对照病毒由上海和元公司构建。将全长人SOX2OT 亚克隆入pLenti⁃CMV⁃MCS⁃3FLAG H155载体，测序验证。YY1过表达BXPC⁃3细胞（BXPC⁃3⁃YY1）感染SOX2OT过表达慢病毒或对照慢病毒。6～8 h 后换液并在荧光显微镜下观察荧光，批量扩增培养后用嘌呤霉素进行细胞筛选，加药浓度由低到高，直至细胞正常培养状态，筛选出稳转细胞株（BXPC⁃3⁃YY1⁃SOX2OT 和BXPC⁃3⁃YY1⁃Vector）。定量RT⁃PCR 证实SOX2OT表达。

1.2.7 SOX2OT siRNA干扰片段转染及筛选

转染前1 d 铺6 孔板（每孔3×105个细胞），长至50%～70%进行转染；Lipofectamine 3000 法体系（每孔）如下：分别以裸培125 μL+siRNA 5 μL，裸培125 μL+Lipofectamine 3000 5 μL两个预混液，各自充分混匀，静置5 min；将两者混合后再次静置15 min，加入换了新鲜完全培养基的6 孔板中；转染24 h 后换液，2～3 d后提取RNA用定量RT⁃PCR进行转染效率验证。3组SOX2OT干扰片段靶序列如下：siRNA⁃1 5′⁃CAAAATAGGTCATAGCAA⁃3′、siRNA⁃2 5′⁃GGA⁃CAAG⁃ACAACATTTGGT⁃3′、siRNA⁃3 5′⁃CTCAC⁃CAATGCTTTAT⁃TCT⁃3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS15.0进行统计分析。定量数据显示为平均值±标准差（）。两组数据比较采用t检验。多组数据比较采用ANOVA⁃SNK检验。所有的统计检验都是双尾检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YY1对胰腺癌细胞中SOX2OT表达的调控

定量PCR及Western blot结果表明：YY1过表达及YY1干扰的稳转细胞株（BXPC⁃3和PANC⁃1）构建成功。定量PCR 结果显示：与对照组相比，YY1 过表达组的BXPC⁃3和PANC⁃1细胞中SOX2OT表达水平被显著抑制（P＜0.05，图1），相反，YY1 干扰组SOX2OT 表达水平与对照组相比显著增加（P＜0.05，图1）。

2.2 YY1对胰腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响

细胞划痕实验结果表明：与对照组相比，YY1过表达抑制BXPC⁃3 细胞的迁移，相反YY1 干扰促进细胞的迁移（图2A）。Transwell 细胞侵袭实验结果表明：与对照组相比，YY1 过表达组穿过基质胶的细胞数显著减少（P＜0.05，图2B），相反YY1干扰组穿过基质胶的细胞数与对照组相比显著增加（P＜0.05，图2B）。

2.3 SOX2OT对YY1的功能回复作用

为了证明SOX2OT是否介导了YY1抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭的作用，在YY1 过表达的BXPC⁃3细胞中过表达SOX2OT，或在YY1敲低的BXPC⁃3细胞中干扰SOX2OT 的表达，观察其是否具有功能回复作用。定量PCR 结果表明：过表达SOX2OT 稳转细胞株构建成功（图3A）；3 组SOX2OT 干扰片段中siRNA⁃1 的干扰效率最高（图3B），因此后续功能回复实验选择siRNA⁃1。细胞划痕实验结果表明：在YY1过表达的BXPC⁃3细胞中过表达SOX2OT，可以逆转过表达YY1 抑制细胞迁移的作用（图3C）；在YY1敲低的BXPC⁃3细胞中干扰SOX2OT的表达，可以逆转YY1 敲低促进细胞迁移的作用（图3D）。Transwell 细胞侵袭实验结果表明：在YY1过表达的BXPC⁃3 细胞中过表达SOX2OT，可以逆转过表达YY1 抑制细胞侵袭的作用（图4A）；在YY1 敲低的BXPC⁃3细胞中干扰SOX2OT的表达，可以逆转YY1敲低促进细胞侵袭的作用（图4B）。

图1 定量PCR及Western blot检测YY1过表达或干扰后胰腺癌细胞BXPC⁃3和PANC⁃1中YY1及SOX2OT mRNAFigure 1 qRT⁃PCR and Western blot analyzed of YY1 and SOX2OT mRNA and protein expression in BXPC⁃3 and PANC⁃1 pancreatic cancer cells with YY1 overexpressing or knockdown

图2 YY1过表达或干扰对BXPC⁃3细胞迁移和侵袭能力的影响Figure 2 Effects of YY1 overexpression or interference on migration and invasion of BXPC⁃3 cells

3 讨论

在本研究中发现YY1过表达抑制，而YY1干扰促进胰腺癌细胞中长链非编码RNA SOX2OT 的表达；YY1 过表达抑制、而YY1 干扰促进胰腺癌细胞的迁移和侵袭。功能回复实验结果表明：在YY1过表达的胰腺癌细胞中过表达SOX2OT，或者在YY1敲低的细胞中干扰SOX2OT的表达，可以逆转YY对胰腺癌细胞迁移和侵袭的作用，YY1 通过下调SOX2OT表达抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。

YY1 对肿瘤的促进或抑制作用与其参与癌基因、抑癌基因、血管生成相关因子和抗细胞凋亡途径密切相关［7］。一方面，YY1 可以通过上调癌基因（如c⁃myc和血管内皮生长因子）的表达，下调抑癌基因（如P53 和E⁃cadherin）的表达发挥促癌作用［8-11］。另一方面，YY1 可以通过上调抑癌基因（如HLJ1 与BRCA1）发挥抑癌作用，并通过直接作用抑制癌基因c⁃myc的功能［12-14］。因此，YY1可以作为一种抑癌基因或癌基因，这取决于组织类型、与其相互作用的蛋白因子及下游靶基因。本课题组先前研究表明YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用［4-5］。ChIP⁃seq 结果表明YY1 可以直接与SOX2OT 的启动子区结合，提示YY1 可能调控SOX2OT 的转录，SOX2OT 可能参与胰腺癌的癌变和进展。

图3 细胞划痕实验检测SOX2OT过表达或SOX2OT干扰对YY1的功能恢复的作用Figure 3 Effects of SOX2OT overexpression or interference on YY1 functional recovery by wound healing assay

图4 Transwell细胞侵袭实验检测SOX2OT过表达（A）或SOX2OT干扰（B）对YY1抑制胰腺癌细胞BXPC⁃3侵袭的影响（×100）Figure 4 Effect of SOX2OT overexpression（A）or interference（B）on cell invasion inhibited by YY1 in BXPC⁃3 cells by transwell cell invasion assay（×100）

SOX2OT 的内含子区包含了干细胞调控因子SOX2 基因。SOX2 是SOX 转录因子家族中的一个主要成员，表达于胚胎干细胞，在胚胎的各个发育过程中起重要作用，是诱导人成体细胞为多能干细胞的一个关键和必需的因子［15］。干细胞和肿瘤都具有自我更新等共同特性，在干细胞起关键作用的基因在肿瘤的发生和发展中也起一定作用。SOX2OT基因定位于3号染色体3q26.3［16］，其确切功能还不清楚。然而，最近研究已经证明了它对SOX2 基因的转录调控作用［17］。类似于SOX2，SOX2OT 在胚胎干细胞中高表达，在诱导分化过程中表达降低，仅表达于正常成年小鼠和人类的大脑组织［18］。SOX2OT 在胰腺癌中的表达模式和生物学作用尚不清楚。本研究发现的几项证据表明SOX2OT 可能是胰腺癌中的一个促癌因子。首先，YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用，而YY1 负性调节SOX2OT 的表达；其次，SOX2OT 的过表达可以逆转YY1 过表达对胰腺癌细胞迁移和侵袭的作用。

总之，YY1 负调控胰腺癌细胞中SOX2OT 的表达。YY1通过下调SOX2OT的表达抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。尽管其他尚未发现的机制可能与YY1 介导的抑癌作用有关，但本研究提示SOX2OT在胰腺癌中起到促癌作用。YY1/SOX2OT轴可能是胰腺癌的一个有价值的诊断和预后指标。