CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥BRI1突变体的鉴定

武国凡 成宏斌 吴玉俊 沈 娟 吴旺泽*

（1. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070；2. 兰州大学生命科学学院，兰州 730030）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因簇是细菌和古生菌基因组中广泛存在的一种DNA重复序列家族。在该重复序列上游还存在一个多态性的Cas（CRISPR associated）蛋白家族基因，它们伴随着细菌和古生菌的进化，形成了一种高度保守的CRISPR/Cas 系统。研究显示，这种特殊的CRISPR/Cas 系统构成了原核生物的获得性免疫防御系统，以抵抗外源遗传物质的入侵［1］。所以研究者利用细菌这种特殊的CRISPR/Cas 系统，开发了继锌指核酸内切酶（Zinc finger endonuclease，ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术之后发展起来的另一种基因组编辑新技术，由于它灵活、高效且易于操作，该技术已成为目前最为热门的基因组编辑工具［2］。

根据Cas结构和功能的不同，CRISPR/Cas系统可大体分为两类，第一类编辑系统对外源基因组的剪切需要一个较大的Cas蛋白复合物和引导RNA；第二类编辑系统对外源基因组的剪切只需要一个单一的剪切蛋白，如Cas9蛋白和cpf1蛋白。因此通过CRISPR/Cas9系统，研究者仅需基于靶基因的基因序列，合成一个含PAM（Protospacer Adjacent Motifs）序列的sgRNA 靶序列，即可通过Cas9 蛋白的核酸内切酶活性可以通过切割靶DNA并形成体内DNA 修复机制并使DNA 双链断裂（DSB）导致基因修饰，造成基因突变（如：插入，缺失和置换）［3～4］。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅在动物遗传突变体的构建，以及遗传性疾病治疗等方面发挥重要作用，而且在作物新品种选育和作物改良中也具有重要意义［5～7］。因此，这一技术的广泛应用，极大加快了人类对功能基因的深入研究。

油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）是一种天然产生的植物激素，在调控植物的生长发育过程中有重要作用［8］。当BR 合成通路或信号转导受损时，其突变体表现出种子萌发率下降、植株极度矮小、开花时间延迟、雄性的育性能力降低、叶片延缓衰老等表型［9］。由于BRs 在植物生长发育过程中具有重要的功能，自从1997 年BR 受体BRI1被克隆鉴定之后，人们通过各种遗传（如EMS 诱变、激活标签和T-DNA 插入筛选等）和生化（如酵母双杂交、双向电泳等）手段对BRs 的信号转导过程进行了广泛且深入的研究［10］。2017 年Sun 等利用TILLING（Targeted Induced Local Lesions In Genomes）技术获得了多个BRI1 突变体，并证实这些突变体中BRI1 不同位点的突变，对BR 信号通路有不同的影响，因此这些突变体的发现为BR 信号通路中早期事件的研究奠定了基础［11］。

本研究利用CRISPR/Cas9 基因组编辑技术，在模式植物拟南芥Col-0 生态型中定向编辑BRs受体BRI1，以期获得新的拟南芥BRI1 的突变体，为进一步阐释BRI1 生物学的功能以及验证其他物种中BRI1同源基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物及培养

野生型拟南芥Col-0，WS2 及BR 突变体bri1-5和bri1-701 均由兰州大学黎家实验室提供。植物材料培养，挑选饱满度均一的拟南芥种子，在EP管中加无菌蒸馏水，4℃春化2～3 d，用移液器点播于营养土中，在温室中22℃长日照培养（16 h光照/8 h 黑暗）。1/2 MS 固体培养基培养无菌的材料，在超净台用75%（v/v）灭菌1 min，用无菌ddH2O 清洗2～3 次，然后1%次氯酸钠（v/v）灭菌15 min，再用无菌ddH2O清洗3～5次。用无菌枪头点播于1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）琼脂的1/2 MS 固体培养基，在超净台吹干后用Prafilm 封口，倒置放于4℃冰箱春化3 d，然后放入培养箱，在22℃长日照培养（16 h 光照/8 h 黑暗）。下胚轴处理实验，4℃春化后，22℃24 h持续暗培养。

1.1.2 菌株和质粒

本实验所用的大肠杆菌菌株（DH5α）和根癌农杆菌菌株（GV3101），CRISPR/Cas 系统载体pCBC-DT1T2 和pHEE401 均由兰州大学黎家实验室提供。

1.1.3 试验试剂

DNA 胶回收试剂盒、植物总RNA 提取试剂盒及质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技公司，DNA 聚合酶和反转录酶购自诺唯赞公司，限制性内切酶购自NEB 公司，TransStart®Top Green qPCR SuperMix 试剂盒购自TransGen Biotech 公司，DNA 提取试剂盒和2，4-表油菜素内酯购自生工生物工程（上海）公司，引物合成（见表3）及测序服务由北京华大公司提供。

1.1.4 数据处理方法

用SPSS 22.0 软件统计分析，Image J 软件测量根和下胚轴的长度，Photoshop CC 2019 软件作图。

1.2 实验方法

1.2.1 sgRNA靶位点的选取

首先从拟南芥数据库（https：//www.arabidopsis.org）中获得AtBRI1 基因序列（AT4G39400）。并登陆CRISPR-PLANT 网站（http：//www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPR search.html）输入目的基因序列，分析获得含有PAM序列的潜在靶位点（见表1）。基于前期对BRI1 突变体的研究报道［11］，BRI1蛋白的N 端在植物信号感知中具有重要作用，我们初步选择了一条位于BRI1 胞外区功能结构域的sgRNA 靶点序列（AGCTCCAAGCCTCTCAACGT-CGG）进行基因定向编辑。

表1 AtBRI1基因中sgRNA序列Table 1 sgRNA sequence in AtBRI1 gene

1.2.2 CRISPR/Cas9-AtBRI1载体构建

合成含靶点序列的引物DT1-BsF，DT1-F0，DT2-R 和DT2-BsR（见表3），以pCBC-DT1T2 为模板扩增获得带有目的序列的基因片段，并通过酶切连接构建表达载体CRISPRCas9-AtBRI1（见表2）。

表2 酶切—连接体系Table 2 Enzyme digestion-connection system

1.2.3 拟南芥的遗传转化与阳性株检测

将载体CRISPR/Cas9-AtBRI1热激转入农杆菌（GV3101），通过花浸法转入拟南芥，获得的种子在含有40 mg·L-1潮霉素的1/2 MS 培养基筛选，获得T0代阳性单株。挑选具有bri1 突变体类似表型的植株叶片DNA 用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）扩增包含编辑位点的片段并测序。

1.2.4 实时荧光定量PCR

选取在1/2 MS 固体培养基生长10 d 的拟南芥幼苗，经1 μm·L-1BL 处理3 h 后提取植物总RNA，反转录合成cDNA 后，以Actin2 为内参，分别检测各样品中CPD，DWF4，BR6ox2 及SAUR-AC1 的表达量，以从分子水平上分析各样品中的BR 信号响应是否受损。依据TransGen Biotech 公司Trans-Start®Top Green qPCR SuperMix 试剂盒用20 μL反应体系进行qPCR，每个样品3 个重复。引物设计及检测方法参考Wu等［12］。

1.2.5 BL处理根长和下胚轴的测量

在超净台上用75%酒精和1%次氯酸钠消毒后的拟南芥种子，点播于添加1 μm·L-1BL 的1%（w/v）蔗糖和0.8%（w/v）琼脂的1/2 MS 培养基上。4℃春化2～3 d，培养皿垂直放置于22℃恒温培养箱进行长日照培养（16 h 光照/8 h 黑暗）。7～8 d 后拍照，用Image J 测量根长并进行统计处理。为了进行BL 对下胚轴敏感性试验，将春化后的培养皿垂直放于22℃恒温培养箱，进行24 h 连续暗培养，7～8 d后拍照，用Image J测量根长进行统计处理。

1.2.6 拟南芥鲜重测定

取生长在温室中22℃长日照培养（16 h 光照/8 h 黑暗）30 d 幼苗进行称重，并通过SPSS 22.0 软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 CRISPR/Cas9-AtBRI1敲除突变体分子鉴定

在拟南芥AtBRI1基因序列239 bp的位置设计四个引物（DT1-BsF、DT1-F0、DT2-R 和DT2-BsR），通过酶切连接体系，该靶序列经退火复性插入到经BsaⅠ酶切的AtU6：sgRNA载体（见图1）。

表3 PCR引物序列Table 3 PCR primer sequence

将构建好的带有AtBRI1 基因靶序列的CRISPRCas9-AtBRI1 的农杆菌，通过pHEE401植物表达载体鉴定引物U626-IDF（TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC）和 U629-IDR（AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC）进行PCR 扩增，其条带大小和预期片段大小相符，表明靶向敲除拟南芥AtBRI1 基因的CRISPR/Cas9 基因组编辑载体已构建成功（见图2A）。为了验证是否成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对野生型Col-0 中的BRI1 进行了靶向基因编辑，提取具有bri1 突变体类似表型的植株叶片DNA，用引物（AtBRI1-F，AtBRI1-R）扩增包含编辑位点的片段并测序（见图2B）。对AtBRI1-F 和AtBRI1-R 扩增获得的条带进行测序分析，发现相比于野生型Col-0，不同的转基因植株中均发现在Col-0 背景BRI1 254 bp 处插入了一个A（见图3：A～C），导致原有序列提前终止（见图3D），我们将通过CRISPR/Cas9 编辑产生的遗传突变体命名为bri1-A。

2.2 AtBRI1突变体表型分析

因为CRISPR/Cas9-AtBRI1载体带有潮霉素筛选标签，所以在1/2 MS 培养基添加40 mg·L-1浓度的潮霉素筛选T0代转基因植株，将抗潮霉素命名为bri1-A（见图4A）；与Col-0 相比，bri1-A 突变体的植株矮小，颜色深绿，叶柄缩短，莲座叶缩小变圆，角果缩短，雄蕊的花丝缩短导致成熟的花粉不能授到柱头上造成雄性不育，bri1-A 突变体与bri1-5突变体相比为强突变体，植株表现的更加矮小，颜色深绿及叶柄缩短等表型。bri1-A 突变体的表型和BR 强突bri1-701 的表型类似，证明bri1-A突变体的表型可能是通过CRISPR 编辑造成了BR信号通路的严重阻断，从而表现出BR 强突变体的类似的表型（见图4C-D），鲜重统计分析表明，bri1-A和背景Col-0差异明显，也远远低于BR弱突bri1-5，但比bri1-701 稍重，这和表型也相符（见图4B）。

2.3 bri1-A对BL的敏感性分析

由于bri1-A 表现出类似于BR 缺失突变体类似的表型，为进一步验证该表型是否是BR 信号通路受损相关，我们通过外源施加高浓度的BL 观察该突变体对BL的敏感性。如图5A和C所示，在用1 μm·L-1浓度的BL 处理时，野生型对照WS2 和Col-0 的根生长均受到明显的抑制，而bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一样，对BL 的敏感性降低。同时我们还观察了在暗培养条件，如图5B，D 所示，高浓度BL 处理对不同植物材料下胚轴伸长的影响，相比于野生型对照WS2和Col-0，在用1 μm·L-1浓度BL 处理后，bri1-A 同bri1-5 和bri1-701 一样，BL 对幼苗下胚轴伸长的抑制明显减弱。因此以上结果从生理层面证明bri1-A同BRI1的其他一些突变体一样对BL 的敏感性降低，说明其产出的各种BR 缺失的表型与BR 信号通路的受阻息息相关。

为了从分子水平证明bri1-A 强烈的BR 突变体表型来自于通过CRISPR 编辑造成的BR 信号受损，我们采用实时荧光定量RT-PCR，检测下游BR合成相关基因CPD，DWF4，BR6ox2，以及下游负反馈调节基因SAUR-AC1 的表达量，以验证突变体中BR 信号通路是否正常［12～13］。如图6 所示，在正常生产情况下，相比于野生型对照，BR 合成相关基因CPD，DWF4 和BR6ox2 在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 中显著上调表达，而负反馈调节基因SAUR-AC1 则显著下调表达。当幼苗经过1 μm·L-1浓度的BL 处理后，在Col-0 和WS2 两种野生型对照 中，CPD、DWF4 和BR6ox2 分 别 降 低78.6%/72.7%、80%/68.9%和87.9%/86.6%，而bri1-5、bri1-701 和bri1-A 仅分别降低4%/7%/14%、22.8%/8.8%/10%和24.4%/8.2%/21.0%，同时负反馈调节基因SAUR-AC1 在野生型对照植株中，经BL 处理后相比于正常植株显著上调表达，而在bri1-5、bri1-701 和bri1-A 上调表达不显著。因此以上结果从基因表达调控层面再次证明bri1-A 对BL 敏感性降低，且突变体中的BR 信号通路被阻断。

3 讨论

T-DNA 插入技术是我们早期研究基因功能常用的一种技术，Gang 等利用该技术甚至在白桦中鉴定到了由T-DNA 插入引起的突变体［14］。但对于特定靶基因的编辑，T-DNA 插入技术往往显得有些捉襟见肘。虽然锌指核酸内切酶（ZFNs）和转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENs）这两种基因编辑技术可以实现定点靶向基因编辑［15～16］，但CRISPR/Cas9 技术在基因编辑中有着更为简单快速的优点［17］，一方面CRISPR/Cas9 技术有较强的可操作性，可以通过Cas9 有目的敲除需要的靶点序列，另一方面，CRISPR/Cas9技术操作方便，且目的基因序列每8 个碱基就能找到一个进行编辑的PAM 序列［18］。基于这些优点，CRISPR/Cas9 技术已得到许多科研工作者认同，到目前为止，CRISPR/Cas9系统在医学领域、植物科学领域以及动物科学领域被广泛认可并成功研究应用。

在植物生长及发育过程中难免会遭受诸如病毒、细菌、真菌甚至昆虫等的侵袭，所以植物在长期进化过程中形成了一系列的防御体系调控网络，而植物激素就该调控网络中扮演着重要角色。已有大量研究显示，油菜素内酯作为一种植物激素除了调控植物的生长发育，也参与植物免疫防御反应［19～24］。因此定位于植物细胞膜上的油菜素内酯的受体BRI1，在植物生长、发育和免疫过程中起着很重要的调控作用［25～27］。但目前越来越多的研究显示，BRI1 不同的位点或结构域在调控不同生物学的过程中起不同作用。所以为进一步了解BRI1 的功能，利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建多种新的BRI1突变体，对BRI1功能的深入理解必定起到积极的推动作用。在本研究中我们初步尝试利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建了一个新的BRI1 突变体bri1-A。如图7 所示，其是由于一个碱基的插入突变，导致正常的BRI1 蛋白序列提前终止。由于现有BRI1 强突变体大多数为某些位点的替换，对某些特定结构域的功能研究产生不便。因此我们的初步尝试为后续BRI1 功能的深入研究提供了参考。

综上所述，本研究利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功获得了新的拟南芥BRI1 突变体，证明利用该技术获得新的突变体就有一定可行性。同时对新突变体的深入研究，我们发现一些新的位点或者某些蛋白序列对基因功能的发挥至关重要，可能不同的位点以及特定的结构域在植物生长发育或植物对生物与非生物胁迫的响应中具有不同的调控作用。这就为今后深入研究特定基因的功能提供了重要遗传基础。由于BRI1 在不同物种中同源性相对较高，且发挥着类似的功能，所以利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术编辑其他物种中的BRI1，为后期分析其他物种中BRI1 的功能，甚至还可为优良作物品种的选育提供优质的种植资源，为推动绿色农业的发展提供动力。