基于网络药理学的黑地黄丸治疗肾性贫血机制探究

张益庆

（浙江省嘉兴市南湖区余新中心医院药剂科 嘉兴314009）

肾性贫血（RA）是由于各种因素造成肾脏促红细胞生成素（EPO）产生不足或尿毒症毒素积累干扰红细胞生成和代谢导致的贫血，是慢性肾衰竭患者常见的并发症之一。 目前西医治疗RA 主要是应用促红细胞生成素及铁剂，但因成本较高，给患者带来巨大的经济压力，临床应用受限。 黑地黄丸主要出自《素问病机气宜保命集》，该集或为张元素所创，黑地黄丸主要由熟地、苍术、干姜、大枣四味药组成[1]。《保命集》言道：“治阳盛阴虚，脾肾不足……面多青黄，而无常色，此药益肾养血。 ”已有研究表明，黑地黄丸可以有效治疗慢性肾衰竭所致RA，可提高RA患者的血红蛋白浓度、红细胞计数，对肾功能有一定保护作用[2]，然而目前对黑地黄丸治疗RA 的机制研究相对较少。 网络药理学是在网络生物和多向药理学的基础上，针对中药多成分、多靶点、多途径等特点，提出研究中药复方或单味药临床作用机制的新方法、新策略，本研究运用网络药理学方法探究黑地黄丸治疗慢肾衰导致的RA 的作用机制。 现报道如下：

1 资料与方法

1.1 黑地黄丸药物成分收集与筛选 基于药代动力学参数：吸收、分布、代谢、排泄（ADME），分别以“熟地”“苍术”“干姜”“大枣”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台数据库（TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 按口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 条件筛选中药成分。

1.2 黑地黄丸有效成分靶点预测 从TCMSP 中查询黑地黄丸有效成分对应的靶标蛋白， 并导入Unitprot 数据库（http://www.Unitprot.org/）查询靶标蛋白的基因名称，同时进行基因标准化处理。

1.3 RA （Renal anemia） 疾病的靶点 预 测 在OMIM 数据库（http://www.omim.org/）、PharmGkb 数据库（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/） 以关键词“Renal Anemia”进行检索，对RA 相关的靶点基因进行收集， 并导入Uniprot 数据库进行基因名标准化处理后归纳整理。

1.4 蛋白互作网络图（PPI）的构建与分析 先将黑地黄丸有效成分作用靶点进行去重， 再与RA 疾病靶点组建“成分-疾病”靶点数据库，取两者交集，组成“成分-疾病”映射文件，即寻找成分与疾病共有的靶点。 运用交集出的共有靶点与化合物成分，通过STRING 数据库建立“黑地黄丸-RA 靶点”的PPI网络。 运用Cytoscape 软件对“有效成分-RA”靶点蛋白互作网络进行节点度（dregree=8.4）值筛选，得到“有效成分-RA”靶点核心网络图。

1.5 GO 生物功能富集分析 将上述作用靶点输入到DAVID 6.8 数据库，进行生物功能富集分析。 再将作用靶点复制到基因搜索列表，对应基因标示符选择“OFFCIAL-GENE-SYMBOL”物种及背景设定为人，然后进行分析获得结果。

1.6 KEGG 代谢通路富集分析 利用DAVID6.8数据库对相应靶点进行代谢通路分析。 物种及背景设定为人，选择KEGG-PATHWAY，并以“P＜0.05”进行筛选，最终得到分析结果。

2 结果

2.1 黑地黄丸的有效成分收集和筛选 通过运用TCMSP 数据库，以“熟地”“苍术”“干姜”“大枣”为关键词进行成分搜索， 共得到黑地黄丸有效成分406个，其中熟地76 个，苍术49 个，干姜148 个，大枣133 个；基于药代动力学参数（ADME），按照口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 条件，进行有效性筛选，同时查阅文献进行补充，共得到黑地黄丸有效成分45 个，其中熟地2 个，苍术9 个，干姜5 个，大枣29 个，由结果得知黑地黄丸主要包含甾醇类、生物碱、苷类、萜类和黄酮类等成分具有良好的OB 和DL 值，如豆甾醇、槲皮素、葡萄糖苷-qt、绣线菊碱A 等。 见表1。

表1 黑地黄丸有效成分

2.2 黑地黄丸有效成分靶点的预测及与成分-靶点网络图的构建 运用TCMSP 网络数据库， 将黑地黄丸45 个有效成分在数据库内进行检索，获取有效成分的对应靶点，共725 个。 并将靶点导入Unitprot数据库（http://www.Unitprot.org/）进行基因名标准化处理，再通过Cytoscape3.7.2 软件构建“黑地黄丸-有效成分-靶点”网络图，该图由183 个节点组成，红色“V”代表中药名，绿色圆形代表黑地黄丸有效成分，粉红色正方形代表有效成分所对应的靶点，节点与节点之间的边表示药物成分与成分靶点之间的相互作用关系，平均自由度8.4，最大自由度104，最小自由度1。 见图1。

图1 黑地黄丸有效成分-靶点网络图

2.3 疾病靶点信息的收集 在OMIM、PharmGkb、GeneCards 数据库中以“Renal Anemia”“RA”为关键词进行数据搜索整理， 其中GeneCards 数据库以“Relevance score＞30”进行筛选，共寻找到靶点基因400 个，其中OMIM（200 个）、PharmGkb（13 个）、GeneCards（187 个）；将以上数据库合并整理后并导入Uniprot 数据库进行基因标准化处理， 再以Uniprot ID 为标准，用EXCEL 表格的“删除重复值”功能，对数据进行去重，最终筛选得到疾病靶点315个；并运用Cytoscape3.7.2 软件构建“疾病-靶点”网络图。 见图2。

图2 RA-疾病-靶点网络图

2.4 靶点相互作用网络构建与分析 利用EXCEL表格筛选功能， 将315 个RA 疾病靶点和725 个药物有效成分靶点进行合并，取两者交集，得到药物成分和疾病的共有靶点17 个，见表2。将这17 个靶点导入STRING 数据库建立“黑地黄丸-RA 靶点”的PPI 蛋白互作网络，见图3，共得到17 个节点，69 条边，平均节点度为8.12；将该结果以STV 格式导出，再通过Cytoscape3.7.2 软件对该网络进行拓扑分析，以“＞平均Degree 值8.11”为筛选标准，得到12个核心节点，它们分别是：白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、干扰素γ（IFNG）、前表皮生长因子（EGF）、血红素加氧酶1（HMOX1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、白介素-2（IL-2）、凝血酶原（F2）、 糖皮质激素受体（NR3C1）、 一氧化氮合酶（NOS3），具体见图4。说明该12 个靶点在整个网络中占据重要地位， 提示这些靶点可能是黑地黄丸发挥治疗作用的关键所在。

表2 药物-疾病共有靶点

图3 PPI 蛋白互作图

图4 核心靶点网络图

2.5 GO生物功能富集分析 运用DAVID6.8 数据库对17 个潜在作用靶点进行生物功能富集分析，确定了129 个GO 条目。 其中生物学过程（BP）条目最多，有107 个：主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控等107 个生物过程；分子功能（MF）相关条目有14 个：主要涉及蛋白质结合、生长因子活性、细胞因子活性、酶结合等分子功能；细胞组成（CC）相关条目有8 个，主要涉及细胞外空间、细胞外区域、细胞质、质膜等；以靶点富集数目多少为原则，筛选出前20 条GO 生物功能富集结果。结果提示：黑地黄丸治疗RA 可能与蛋白质结合、细胞外空间、细胞质、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物功能有关。 见表3。

表3 前20 条GO 生物功能分析

2.6 KEGG 代谢通路富集分析 运用DAVID6.8数据库对17 个潜在作用靶点进行代谢通路富集分析，共获得39 条通路。以P＜0.05 为条件筛选，按富集基因数降序原则排序， 得到前20 条KEGG 代谢通路， 其中富集靶点数目前三位的通路主要包括：HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症的途径（Pathways in cancer）。 以上数据显示，黑地黄丸的有效成分可能通过作用于这些代谢通路发挥其治疗RA 的潜在作用。 见表4。

表4 前20 条KEGG 代谢通路富集分析

3 讨论

RA 在中医学中并无具体病名， 但近代中医医家学者将其归属于“肾劳、虚劳、血枯”等范畴。 病因多为先天不足、后天失养、外感邪气、内伤劳倦、情志久病、房劳伤肾等有关。 肾病后期五脏俱虚，浊邪壅滞脾胃，使脾胃受纳水谷精微失调，气血化生无源，故气血亏虚；精可化血，血可养精，肾病日久，肾精亏虚，则血源不足，使贫血加重；故脾肾亏虚为该病的基本病机。

黑地黄丸在治疗慢性肾脏病及其并发症、 改善肾功能方面具有良好效果。 中药具有多成分、 多靶点、多途径的特点，本研究运用网络药力学方法探讨黑地黄丸治疗RA 的物质基础和分子作用机制。 研究结果显示， 黑地黄丸与RA 共有17 个公共靶点，经过PPI 网络分析和拓扑分析后共得到12 个核心靶点 ：IL-6、TNF、VEGFA、EGFR、IFNG、EGF、HMOX1、TP53、IL-2、F2、NR3C1、NOS3，提示该药治疗RA 具有多组分、 多靶点的特点。 现代医学认为RA 多属慢性病贫血（ACD），可能与铁吸收异常、巨噬细胞释放铁障碍、EPO 表达异常等有关。 有研究显示IL-6 通过炎性机制反应，可引起铁代谢紊乱导致贫血，从而参与造血调控[3]；TNF-琢是造血负调控因子，影响铁代谢，可以抑制红系造血功能[4]；林雪峰等[5]分析发现免疫及炎症反应所介导的TNF-琢和IL-6 可能通过影响铁代谢和EPO 生成抑制、EPO 的反应钝化等途径参与ACD 的发生发展；王欢等[6]研究发现贫血情况下VEGFA 生成增多， 会促进组织血管生成，从而代偿性增加氧气利用率；HMOX1 可分解血红素产生铁，是铁在体内重复利用的重要来源，在铁代谢中发挥关键作用；因此可以推测其调节障碍会导致铁的缺乏，从而引起贫血；EGF 可能与骨髓血管生成和造血有关[7]；众多研究发现细胞毒性T淋巴细胞可分泌造血负调控因子IFN-γ，具有较强的造血抑制活性[8]；NOS 作为合成一氧化氮（NO）的关键酶，也是造血负调控因子，INF-γ 还能强烈诱导一氧化氮合酶表达，通过促进NO 合成、释放来抑制造血功能；还有研究发现贫血与免疫机制密切相关[9]，IL-2 不仅可反映T 细胞的功能，并且IL-2 异常与再生障碍性贫血（AA）的造血抑制有关。 由KEGG 代谢通路富集分析发现靶点蛋白富集在HIF-1 信号通路上数目最多， 预测黑地黄丸治疗RA 可能主要通过该通路发挥作用；HIF-1（低氧诱导因子）通过模拟机体缺氧，刺激机体产生内源性EPO，可提高红细胞对铁的利用性， 从而实现治疗RA 的目的[10]；PI3K-Akt 信号通路参与调节造血干细胞的生长、增殖和存活等重要生物过程，过度激活该信号通路会造成造血干细胞的耗竭[11]；癌症与炎性反应密切相关， 富集在癌症通路上的EGFR，IL-6，VEGFA，TP53，EGF 等可能通过炎症反应、细胞增殖与分化、氧化应激等生物过程参与对RA 的治疗； 于生友等[12]研究发现PI3K/Akt 信号通路在肾小球足细胞凋亡中发挥保护肾小球足细胞作用； 推测黑地黄丸可以通过利用以上多种通路的调控保护肾功能， 改善尿毒症诱导的红细胞生成抑制、铁利用障碍[13]等。

综上所述，黑地黄丸治疗RA 具有多靶点、多通路、多成分特点，同一靶点可通过多个信号通路和生物过程发挥作用，其机制较为复杂。本研究明确了黑地黄丸治疗RA 的物质成分基础及潜在作用靶点，并通过富集分析阐释了黑地黄丸作用的信号通路和分子机制， 为RA 的临床治疗和实验研究提供了新方法、新思路。