8种杀菌剂对9种薄壳山核桃炭疽病病原菌的毒力测定

2021-03-19张亚波李志红翟凤艳舒金平

林业科学研究 2021年1期

孟珂，张亚波，常君，李志红，王迪，翟凤艳＊，舒金平

(1.河南科技学院，河南新乡 453003；2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江杭州 311400)

炭疽菌（Colletotrichumspp.）是一类重要的植物病原真菌，分布广泛，在热带和亚热带地区尤为突出[1]。炭疽菌可侵染植物叶、花、果、茎及嫩枝等，引发各种植物炭疽病，造成叶斑、叶枯、花腐、果腐和枝枯等症状，严重时导致落叶、落花和落果，甚至植株死亡，给农林业生产造成极大损失，被称为世界第八大植物致病真菌群[2]。

薄壳山核桃（Carya illinoinensis(Wangenh.) K.Koch）又名美国山核桃、长山核桃，原产于美国与墨西哥北部，是重要的木本油料树种[3-5]。薄壳山核桃种仁油脂含量达65%以上，其中，不饱和脂肪酸含量90%以上，其果实是世界著名干果之一[6]。近年来，随着我国南方薄壳山核桃种植面积的不断扩大，病虫害发生日益严重[7-8]，在浙江、江西和云南等薄壳山核桃主栽区爆发黑斑病，落叶、落果现象严重，造成重大的经济损失。研究发现，炭疽菌是引发薄壳山核桃黑斑病的关键病原菌。由于该病具有潜伏期长、发病时间集中、爆发性强等特点，选择高效、低毒的化学药剂进行防治是一种有效策略。

国内外学者针对炭疽菌的药效试验开展了大量研究，筛选出了一系列高效药剂，但不同种或同种菌不同菌株对杀菌剂存在着一定的特异性[9]，如戊唑醇对柿树炭疽菌（C.gloeosporioides(Penz.)Penz.and Sacc）具有较好的抑制作用[10]，而对辣椒炭疽菌（C.gloeosporioides(Penz.) Penz.and Sacc）抑制作用较差[11]。作者从不同地区的薄壳山核桃病叶和病果中，分离到26 株炭疽菌，通过形态学特征和多基因序列分析共鉴定出9 种炭疽菌。先前应用于其它植物炭疽病防治的杀菌剂对薄壳山核桃炭疽病病菌的防治效果尚不清楚。因此，本研究利用菌丝生长速率法测定了8 种杀菌剂对9 种炭疽菌的室内毒力，以期筛选出高效低毒的杀菌剂，为薄壳山核桃炭疽病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株供试的9 种引起薄壳山核桃炭疽病的炭疽菌菌株分别收集自浙江、江西、安徽及云南4 地薄壳山核桃感病的叶片和果实（图1），经分离纯化后于PDA 斜面培养，4℃保存备用。菌种/株的详细信息见表1。

图1 薄壳山核桃黑斑病症状Fig.1 Symptoms of black-spot disease of pecan

1.1.2 供试药剂供试药剂原药均由丙酮溶解，分别配制成10 mg·L-1的药剂母液，置于4℃冰箱保存备用。供试药剂及试验浓度梯度见表2。

1.1.3 培养基马铃薯琼脂糖（PDA）培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g 蒸馏水1 000 mL。

1.2 实验方法

采用菌丝生长速率法[10]测定8 种杀菌剂对炭疽病菌的毒力。按试验浓度梯度配置含药剂的PDA 培养基。将病原菌于PDA 培养基上，25℃下预培养5 d 后，在靠近菌落边缘打取直径5 mm 的菌饼，接种于含药PDA 培养基上，每个处理放置1 个菌饼，设置3 个重复，于25℃培养箱中培养6 d 后，采用十字交叉法测量每个菌落的直径，计算抑制率（抑制率=((对照组菌落直径-药剂组直径菌落直径)/对照组直径)×100%)。基于抑制率构建回归方程，并计算抑制中浓度(EC50)。各处理均以丙酮为对照(CK)，每处理重复3 次。

1.3 数据处理与分析

利用DPSV14.10 软件构建各药剂对不同菌种/株的毒力回归方程（95%的置信限），并计算EC50值。利用SPSS 19.0 软件，采用单因素方差分析（One-way ANOVA，LSD）进行不同药剂EC50值差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对C.fioriniae 的毒力测定

建立8 种药剂对C.fioriniae6 个菌株的毒力回归方程，并计算出各药剂对C.fioriniae及各菌株的抑制中浓度，结果（表3）表明：8 种杀菌剂对C.fioriniae菌丝生长的抑制作用差异显著(F(7,40)=12.507，P<0.001）；咯菌腈、咪鲜胺、戊唑醇和恶醚唑的抑制作用最强，平均EC50值分别是0.13、0.15、0.58、0.64 mg·L−1；其次甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯及嘧菌酯，平均EC50值分别是4.39、5.50、7.88 mg·L−1；代森锰锌的抑制效果最差，平均EC50值仅为43.40 mg·L−1。同一杀菌剂对同一菌种不同菌株菌丝生长的毒力也存在着差异。戊唑醇对供试的6 个菌株菌丝生长抑制作用差异最大，其对JD179 菌株的毒力(EC50=2.46)是JD756菌株(EC50=0.04)的61.5 倍；其次，吡唑醚菌酯和咯菌腈2 种药剂对不同菌株毒力最大差异倍数分别是55.5 倍和27.0 倍；甲基硫菌灵、恶醚唑、咪鲜胺、嘧菌酯对6 个菌株的毒力差异变化相对小，最大差异倍数仅为1.61～3.83 倍（表3）。

2.2 不同杀菌剂对C.fructicola 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.fructicola菌丝生长的抑制作用差异显著（F（7,56）=7.320，P<0.001）（表4）。咯菌腈和咪鲜胺的抑制作用最强，平均EC50值分别为0.11、0.13 m·L−1；对菌株JX073 的抑制效果较好的杀菌剂有吡唑醚菌酯（EC50=0.01 mg·L−1）、甲基硫菌灵（EC50=0.14 mg·L−1）、咯菌腈（EC50=0.39 mg·L−1）、代森锰锌（EC50=0.45 mg·L−1）、咪鲜胺（EC50=0.61 mg·L−1）；戊唑醇对菌株JX0731（EC50=0.53 mg·L−1）抑制效果较好。

2.3 不同杀菌剂对C.nymphaeae 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.nymphaeae菌丝生长的抑制作用存在显著差异（F（7,24）=5.35，P=0.001）（表5）。咪鲜胺、咯菌腈和恶醚唑对菌丝生长抑制作用最好；其次为嘧菌酯、戊唑醇、甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯；代森锰锌抑制作用最差。同一杀菌剂对不同菌株菌丝生长的毒力也存在着差异。戊唑醇的EC50值变异最大，对JD043 菌株的EC50值是JD3 的326.67 倍；其次，吡唑醚菌酯、嘧菌酯和恶醚唑的毒力差异倍数分别是14.36、11.30、11.17 倍；咪鲜胺、咯菌腈、代森锰锌及甲基硫菌灵对4 个供试菌株的毒力差异相对稳定，毒力差异倍数为2.33～4.61 倍。

表1 供试菌株Table 1 Information of strains for test

表2 供试药剂及浓度Table 2 Fungicides and their concentration for tests

表3 不同杀菌剂对C.fioriniae 不同菌株菌丝生长的毒力测定Table 3 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.fioriniae

续表 3

表4 不同杀菌剂对C.fructicola 不同菌株菌丝生长的毒力测定Table 4 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.fructicola

2.4 不同杀菌剂对C.siamense 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.siamense菌丝生长的抑制作用差异显著（F（7,8）=22.553，P<0.001）（表6）。咯菌腈、咪鲜胺的毒力较高，代森锰锌的抑制作用最差；吡唑醚菌酯、恶醚唑、甲基硫菌灵和戊唑醇对JX23 菌株的抑制作用高于CZ622 菌株，戊唑醇对2 个菌株的毒力变异最大，对CZ622 菌株的EC50值是JX23 菌株的14.34 倍。

2.5 不同杀菌剂对C.alienum 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.alienum菌丝生长的抑制作用差异显著（F（7,8）=18.45，P<0.002）（表7）。咯菌腈、咪鲜胺及恶醚唑的抑制作用相对较好，平均EC50值分别为0.09、0.14、0.90 mg·L−1。其次是嘧菌酯、甲基硫菌灵及吡唑醚菌酯3 种药剂。同一杀菌剂对不同菌株的菌丝生长抑制作用也具有差异，戊唑醇对供试菌株抑制差异最大，最高EC50值是最低值的215.69 倍；咪鲜胺、恶醚唑毒力差异倍数分别是3.00、2.98 倍；甲基硫菌灵、代森锰锌、吡唑醚菌酯、咯菌腈、嘧菌酯对2 个供试菌株的毒力差异倍数最小，为1.34～1.79 倍。

表5 不同杀菌剂对C.nymphaeae 不同菌株菌丝生长的毒力测定Table 5 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.nymphaeae

2.6 不同杀菌剂对C.tamarilloi 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.tamarilloi菌丝生长的具有一定的抑制作用（表8），其中，咯菌腈、咪鲜胺和戊唑醇对C.tamarilloi菌株的抑制作用较好，EC50值小于1.00；而代森锰锌的对C.tamarilloi菌株的抑制作用较差（EC50=71.63）。

表6 不同杀菌剂对C.siamense 不同菌株菌丝生长的毒力测定Table 6 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.siamense

2.7 不同杀菌剂对C.americae-borealis 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.americae-borealis菌丝生长的抑制作用有明显差异（表9）。咪鲜胺、咯菌腈及戊唑醇对供试菌株菌丝生长有较强的抑制作用，EC50值为0.01～0.48 mg·L−1；代森锰锌EC50值为47.10 mg·L−1，对C.americae-borealis的毒力相对较差。

2.8 不同杀菌剂对C.coelogynes 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.coelogynes菌丝的生长均存在抑制作用（表10），其中，咪鲜胺对菌丝生长抑制效果佳，EC50值为0.10 mg·L−1；代森锰锌和戊唑醇对菌丝生长的抑制作用较差，平均EC50值为33.29 和62.40 mg·L−1。

2.9 不同杀菌剂对C.liaoningense 的毒力测定

8 种杀菌剂对C.liaoningens菌丝的生长均表现出一定的抑制作用（表11）。8 种杀菌剂中，咪鲜胺（EC50=0.13 mg·L−1）、咯菌腈（EC50=0.24 mg·L−1）及戊唑醇（EC50=0.48 mg·L−1）EC50值均小于1.00，抑制效果较好。

2.10 不同杀菌剂对供试26 株炭疽菌的毒力

将8 种杀菌剂对26 株炭疽菌的毒力进行了总体分析，结果（图2）表明：8 种杀菌剂对供试菌株的毒力不同，其中，咪鲜胺和咯菌腈2 种药剂对所筛选的9 种炭疽菌、26 个菌株的菌丝生长抑制作用最强，EC50值为0.01～0.28 mg·L−1，平均EC50值分别为0.14 和0.15 mg·L−1；其次为恶醚唑，EC50值为0.51～2.08 mg·L−1，平均EC50值为1.08 mg·L−1；再次为甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯和嘧菌酯，EC50值为0.24～22.12 mg·L−1，平均EC50值分别为4.13、6.12、6.94 mg·L−1；代森锰锌对26株炭疽菌菌丝抑制作用差异较大，EC50值均在17.23 mg·L−1以上，其中，3 株炭疽菌EC50值超过100.00 mg·L−1。

3 讨论

本研究采用菌丝生长速率法，测定了8 种杀菌剂对9 种炭疽菌、26 个菌株的室内毒力，结果表明：咪鲜胺和咯菌腈对26 株炭疽菌均具有较高的生长抑制作用，且菌株对其均较敏感，其次为恶醚唑和甲基硫菌灵。

表7 不同杀菌剂对C.alienum 不同菌株菌丝生长的毒力测定Table 7 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.alienum

表8 不同杀菌剂对C.tamarilloi 同一菌株菌丝生长的毒力测定Table 8 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.tamarilloi

表9 不同杀菌剂对C.americae-borealis 同一菌株菌丝生长的毒力测定Table 9 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.americae-borealis

表10 不同杀菌剂对C.coelogynes 同一菌株菌丝生长的毒力测定Table 10 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.coelogynes

表11 不同杀菌剂对C.liaoningense 同一菌株菌丝生长的毒力测定Table 11 Toxicity test of different fungicides against mycelial growth of C.liaoningense

图2 8 种杀菌剂对26 株炭疽菌的毒力Fig.2 Virulence of 8 fungicides for 26 strains of Collelotrichum spp.

炭疽菌属（ColletotrichumCda.）是一个复杂的属，包括多个致病种，且部分种致病力极强，给农业生产带来巨大损失[1,12]。大量研究表明，不同炭疽菌种/菌株对杀菌剂的敏感性存在显著差异[13-15]。刘霞等[15]研究表明，咪鲜胺和戊唑醇对4 株胶孢炭疽菌（C.gloeosporioidesPenz.）菌丝生长的抑制作用较高，甲基硫菌灵和代森锰锌对4 株胶孢炭疽菌菌丝抑制效果差异显著。高杨杨等[11]研究认为，吡唑醚菌酯、咯菌腈对尖孢炭疽菌（C.acutatumSimmonds）的菌丝生长和孢子萌发均具有很高的抑制效果。陈圆等[16]研究认为，25%吡唑醚菌酯乳油、50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂和430 g·L−1戊唑醇悬浮剂对火龙果（Hylocereus polyrhizusWebb.Britton &Rose）胶孢炭疽菌的抑制效果较好。也有研究表明，甲基硫菌灵、代森锰锌和咪鲜胺等常用杀菌剂对炭疽菌引起的辣椒炭疽病的田间防治效果差[17]；炭疽菌对甲基硫菌灵等苯并咪唑类药剂具有较强的耐受力[18-19]。本研究结果表明，所选用的8 种药剂（6 类）对9 种炭疽菌的菌丝生长抑制效果显著不同，且同一药剂对同种炭疽菌的毒力因菌株的不同呈现出明显差异；所筛选的咪鲜胺和咯菌腈适用性最广，对9 种炭疽菌、26 个菌株均具有较高的生长抑制作用，其次为恶醚唑和甲基硫菌灵；但代森锰锌对9 种炭疽菌、26 个菌株的抑制作用不明显。

研究表明，同一药剂的反复施用易迫使病虫产生抗药性[20-21]。李河等[22-23]发现，我国油茶（Camellia oleiferaAbel.）苗圃炭疽病菌已对多菌灵、乙霉威和戊唑醇产生严重的抗药性。本研究结果表明，戊唑醇和代森锰锌对26 个菌株的EC50值差异较大，分布在0.04～100.00 mg·L−1，吡唑醚菌酯和嘧菌酯次之，EC50值分布在0.24～22.12 mg·L−1之间，说明个别菌株对以上4 种药剂敏感性可能降低；同时还发现，来自不同地理位置的菌株对不同杀菌剂的敏感性不同。浙江建德和浙江金华的菌株，对咪鲜胺、咯菌腈和戊唑醇较敏感；来自云南玉溪的菌株对咪鲜胺、咯菌腈、恶醚唑和甲基硫菌灵较敏感，安徽滁州的菌株对咪鲜胺、咯菌腈、恶醚唑和嘧菌酯较敏感；江西吉安的菌株对咪鲜胺、咯菌腈、吡唑醚菌酯和甲基硫菌灵较敏感。建议在生产中因时因地合理选择杀菌剂防治薄壳山核桃黑斑病。