滇重楼叶片多糖提取工艺优化研究
2021-03-19杨青李甜甜杨羚钰茹瑞红陈显梅
杨青 李甜甜 杨羚钰 茹瑞红 陈显梅
(云南省文山壮族苗族自治州农业科学院 云南文山 663099)
滇重楼［Paris polyphyllaSmith var．yunnanensis（Franch.） Hand. -Mazz］是 黑 药 花 科Melanthiaceae 重楼属Paris 多年生草本植物，是传统名贵中药材［1］，2015 年中国药典收录主要种之一［2］。现代研究表明，重楼具有抗肿瘤、抗缺血性损伤、抗病毒、免疫调节、止血、镇痛、抗菌、抗血小板聚集、抗炎等生物活性，是云南白药、宫血宁胶囊、楼莲胶囊、清咽胶囊、季德胜蛇药片、热毒清胶囊、金复康口服液等中成药的主要原料［3-5］，含有甾体皂苷、蜕皮激素、甾醇、甾醇苷、黄酮苷、氨基酸、脂肪酸、微量元素、多糖等多种化学成分［6］。目前国内外对重楼属植物的研究报道主要集中在生药学鉴定、化学成分的分离提取、人工栽培、组织培养及快速繁殖、总皂苷的活性研究、临床应用等方面，多糖亦为重楼活性成分之一，但有关重楼多糖的研究相对较少［7］。重楼多糖有很好的药理作用，多糖及其复合物分子所具有的复杂的、多方面的生物活性已引起了生物学界、化学界、医药界的极大兴趣，目前已有猪苓多糖、香菇多糖、灵芝多糖、桔梗多糖等应用于临床［8-10］。有研究表明，滇重楼多糖具有显著的免疫增强作用［11］，以及抗炎、抗病毒、抗辐射等功效［12-18］。在提取方法上，采用了回流提取、超声辅助提取和热水提取等方法，优化工艺分别采用了正交法和反应面法［19-23］，但是结果差异较大，有必要进行实验验证和方法确定。本实验将采用超声波辅助提取法从滇重楼中提取多糖，利用单因素和正交设计优化提取方法，以期最大程度提高滇重楼多糖得率，为进一步深入研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材
滇重楼样品采集于云南省西畴县西洒镇，并经长期从事重楼研究工作的高级农艺师陈达菊鉴定为黑药花科植物滇重楼Paris polyphyllavar.yunnanensis的叶片。
1.1.2 试剂
无水葡萄糖对照品、无水乙醇、石油醚、苯酚、浓硫酸、蒽酮溶液、氯仿、碘化钾、三氯甲烷、丙酮、乙醚。以上试剂均为分析纯。a-淀粉酶为生化试剂，购自北京奥博星生物技术有限公司。
1.1.3 实验仪器
超纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）；高速多功能粉碎机（浙江永康市天棋盛世工贸有限公司）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GL-2050M 高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；UV-2450 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SB-5200DTN 型超声波清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅 （江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；RV10 basic V 型旋转蒸发仪德国IKA 集团；eppendorf 移液器（德国eppendorf）；boekel 干浴锅（美国）；HG-9145A 电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；MS204S/01 电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 滇重楼叶片多糖提取优化
1.2.1.1 单因素实验
把新鲜滇重楼叶片清洗干净，40℃杀青1 h，60℃烘干，打粉，过40 目筛。精确称取10 g 重楼叶片粉末各3份，分别置于圆底烧瓶中，用适量石油醚回流脱脂，脱脂后分别按料液比精密量取超纯水倒入锥形瓶中，用甲醇浸提，去提取液，然后置于恒温水浴锅中进行提取。单因素实验，除去考察因素，其他实验条件为温度80℃，料液比1∶20，提取时间60 min，提取次数1 次。每个处理设3个重复。单因素实验设计如下：
（1）在提取温度80℃，提取时间60 min，提取1 次的条件下，考察不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100）对滇重楼叶片多糖提取率的影响。
（2）在提取温度80℃，料液比为1∶20，提取1 次的条件下，考察不同提取时间（30、60、90、120、150 min）对滇重楼叶片多糖提取率的影响。
（3）在料液比为1∶20，提取时间60 min，提取1 次的条件下，考察不同提取温度（70、80、85、90、95℃）对滇重楼叶片多糖提取率的影响。
（4）在提取温度80℃，料液比为1∶20，提取时间60 min 的条件下，考察不同提取次数（1、2、3、4次）对滇重楼叶片多糖提取率的影响。
1.2.1.2 正交设计优化提取
在单因素实验基础上，以时间、温度、料液比、提取次数为考察因素，设计L9（34）正交实验来确定提取滇重楼多糖的最佳提取工艺。根据单因素实验的结果选取正交设计的因素和水平及编号，具体见表1。
表1 实验设计
1.2.2 多糖的测定
1.2.2.1 标准溶液配制
准确称取在105℃下干燥至恒重的葡萄糖0.05 g，加纯水配制成浓度为0.1 mg/mL 的标准溶液备用。
1.2.2.2 绘制标准曲线
分别吸取上述标准溶液适量至试管中，加水补足2 mL，分别配成浓度为7.5、22.5、37.5、52.5、67.5 μg/mL 的溶液，置于冰水中再加入蒽酮溶液6 mL，摇匀，于100℃沸水浴显色15 min，冷却至室温，以2 mL 纯水作对照，加入显色剂，相同条件下显色，625 nm波长测吸光度。
1.2.3 样品的测定
分别精密称取经过1.2.1.1 提取的滇重楼叶片多糖和量取1.2.2正交优化工艺提取的滇重楼叶片粗多糖供试品溶液0.5～2.0 mL 至10 mL 具塞刻度试管中，照标准曲线的制备方法，准备各组供试样品，依次在625 nm 波长测定吸光度，对照标准曲线计算出供试品溶液中多糖的浓度，计算公式如下［24］：
式中：C—由葡萄糖标准曲线计算得到的多糖含量；V—提取液定容体积（mL）；W—样品取样质量（g）。
2 结果与分析
2.1 标准曲线制作
以葡萄糖检测浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。即得标准曲线方程：
y=0.012X+0.014 4，R2=0.999 2。
2.2 滇重楼叶片多糖提取工艺的优化
2.2.1 滇重楼叶片多糖提取工艺的单因素优化
单因素实验按1.2.1.1的实验方法进行，然后检测数据，根据标曲曲线方程式计算得到数据，见表2。从表2 可以看出，单因素最佳提取条件：时间60 min、温度85℃、液料比80∶1、提取次数3次。
表2 不同单因素对滇重楼多糖含量的影响
2.2.2 滇重楼叶片多糖提取工艺的正交法优化
采用1.2.1.2的方法进行优化，采用紫外可见分光光度计进行检测，数据按标准曲线方程计算得到各组合数据（表3）。由表3可知，滇重楼叶片多糖提取的各因素最优组合为：时间30 min、温度90℃、液料比80∶1、提取次数3次。
表3 不同组合对滇重楼多糖提取的影响
3 讨论
有研究表明，滇重楼中的皂苷及多糖具有较强的生理活性，如抗癌、抗生育、抑菌、镇痛、镇静、止咳平喘、止血、抗氧化、增强免疫等［12-18］，在临床上主要用于治疗出血、炎症、癌症等疾病［14-17］。李敏敏等［25］研究表明，重楼提取物对植物病原菌柑桔病原真菌、柑桔链格孢茵、柑桔褐腐疫霉菌、柑桔炭疽菌具有明显抑制作用。滇重楼地上部分具有多种活性成分［18，25］。现代研究多集中于重楼地下部分，从块根中提取皂苷等其他化学成分，而地上茎叶部分容易被丢弃，造成资源浪费，滇重楼地上茎叶生长速度快，还未得到很好地研究利用。从滇重楼茎叶中提取活性成分不仅能有效避免资源浪费，而且滇重楼叶中含有的活性成分多糖具有多种作用。重楼多糖的提取可以采用回流、超声辅助和热水提取等方法，运用热水提取法成本较低、操作方便，比较适宜应用于工厂化大规模生产。本实验对滇重楼叶片多糖采用热水提取法进行了单因素和正交设计优化，得到了优化提取方案，为以后重楼地上部分的提取提供了参考方法，充实了数据，为滇重楼新资源扩充开发利用等方面奠定了基础。
