医用镁合金表面肝素/蒙脱石涂层耐蚀性研究

田景睿，李慧，邹玉红，曾荣昌

（山东科技大学 a.化学与生物工程学院 b.材料科学与工程学院，山东 青岛266590）

目前，介入性血管支架仍是治疗心脑血管缺血性疾病的主要方法之一，医用金属材料在其中发挥着举足轻重的作用。随着现代医学和生物材料学的发展，研究重点聚焦于生物可降解支架，其最大的特点在于可降解性，因此，患者需要二次手术将支架取出的问题迎刃而解[1]。近年来，研究最多的生物可降解支架有可降解聚合物支架、可降解镁合金支架、可降解铁合金支架和可降解锌合金支架[2]。聚合物材料的降解行为可通过控制其分子量、单体种类和侧枝基团得到调控，如Igaki-Tamai 支架[3]、XINSORB 支架[4]，但是与金属材料相比，它们都存在支撑力不足、支架壁较厚、对血管有刺激作用等问题，大大限制了其临床应用[5]。铁合金作为支架材料表现出良好的机械性能及可视性，但其降解速率过慢的问题[6]，增加了炎症发生的风险。锌合金是一种新型生物可降解合金，有研究表明在大鼠试验中，锌基支架可表现出令人接受的生物相容性，但会导致慢性和急性炎症发生，且其在体内外的降解机制和产物代谢吸收等问题仍待进一步研究[7]。镁合金作为心血管支架材料具有诸多优点，如镁可参与人体代谢[8]，具有低血栓源性，是ATP酶的辅因子，可抑制血管内再狭窄，维持血管壁张力[9]等。Erbel[10]将71 个可降解镁合金支架（长10～ 15 mm，直径3.0～3.5 mm）植入63 例病人的冠状动脉中，术后血管狭窄率由(61.5±13.1)%降至(12.6±5.6)%。但镁合金在人体内表现出良好生物相容性的同时，也面临着降解速度过快的问题[11]。镁合金植入物降解过快使其机械性能降低，表面粗糙度增加，局部血液pH 值过高[12]，由此引发血栓、血管弹性回缩及血管再狭窄等一系列问题，从而限制了该类支架的应用。目前，表面修饰成为了降低镁合金腐蚀速率的主要方法，同时为了解决支架植入后的再狭窄等问题，在支架表面携带各种药物成为大势所趋。Xu 等[13]将负载西罗莫司（一种防止内膜增生的药物）的丝素蛋白作为AZ31 镁合金支架涂层的聚合物，研究表明丝素蛋白涂层减缓了药物从丝素层的释放，提高了支架的耐腐蚀性能，降低了血管再狭窄的风险。Ye 等[14]筛选了一种普通的口服阿托伐他汀钙，并将其加载到AZ31 镁合金表面的聚三亚甲基碳酸酯中，得到了具有降解速率可控、靶向药物递送和血管重塑等优点的支架材料。

蒙脱石（又称蒙脱土）是一种天然的片层状铝硅酸盐黏土矿物，具有良好的阳离子交换能力和吸附性能，可作为黏膜保护剂[15]、抗菌缓释剂[16]和分散剂[17]等，被广泛应用于医疗行业。许多临床医生[18-20]将蒙脱石用于消化道止血，取得较满意的临床疗效。王建坤等[21]建立了大鼠肝脏出血模型，研究蒙脱石对肝脏创面的止血作用。结果表明，蒙脱石体外和体内的凝血时间均比空白对照组、壳聚糖止血粉组明显缩短，具有显著的促进创面止血功能及良好的生物安全性。笔者所在的课题组在镁合金表面改性[22-24]、耐蚀性[25-27]、抗菌性[28-29]、生物相容性[30-31]等方面做了许多工作。前期已将MMT 成功制备到镁合金表面，在此基础上制备Zn-MMT[32]及MMT/BSA 涂层[33]，结果表明这两种涂层提高了镁合金的耐蚀性及生物相容性，Zn-MMT 涂层的抗菌性能优越。

肝素是一种含磺酸基、磺氨基、羧酸基的天然阴离子多糖类化合物，具有抗血栓、抗炎、抗过敏和降血脂等多种功能，是一种理想的抗凝血物质。采用肝素功能化来提高医用高分子材料的抗凝血性能已经有几十年的历史。肝素在体内与抗凝血酶III 、肝素结合蛋白和血小板因子等活性物质结合后发挥抗凝血作用。在血管支架领域，研究人员常常将肝素制备载药涂层[34-35]，解决支架植入后血管再狭窄的难题，效果显著。

也有研究人员尝试将蒙脱石、肝素联合应用。如陈亚红等[36]将抗凝血肝素-季胺盐插层蒙脱土制备成蒙脱土纳米抗凝血中间体，然后与硅橡胶复合制备硅橡胶蒙脱土纳米抗凝血复合材料，其具有较好的抗凝血性能。Meng 等[37]采用插层法制备了肝素苯扎尔铵改性蒙脱土/聚二甲基硅氧烷膜，抗凝性能明显优于纯聚二甲基硅氧烷膜。但这些研究都局限在抗凝材料方面，将两者联合应用在可降解镁合金支架方面尚未见报道。

肝素是一种天然的具有阴离子特性的凝血抑制剂，具有强抗凝血作用，可将其与具有阳离子表面的材料进行结合，得到肝素化亲水性材料。当其与血液接触时可持续释放肝素，以防止局部血栓的形成，达 到抗凝血的效果。在金属表面制备的肝素涂层不仅具有良好的血液相容性，可延缓或阻止血管内支架置入早期形成血栓的过程，而且具有良好的稳定性，有利于维持金属良好的机械性能[38]。

因此，本试验在Na-MMT 涂层的基础上，采用浸泡法，利用正负电荷相互吸引作用，使带有负电荷的肝素与蒙脱石层间的阳离子形成离子键，从而将其固定在蒙脱石内表面得到HS-MMT 抗凝涂层，提高涂层的血液相容性。利用离子键将肝素固定在材料表面的结合方式能够维持肝素的天然构象，因而最大限度地优化了涂层的抗凝效果[36]。本试验拟采用水热法在镁合金表面制备蒙脱石涂层，并采用浸泡法制得肝素/蒙脱石复合涂层以提高其耐蚀性和抗凝血性能，为可降解镁合金血管支架表面改性提供了一种新方案。

1 试验

1.1 试剂及仪器

试剂包括：钠化蒙脱石（药品级）购于浙江丰弘有限公司；肝素钠（生物试剂）购于上海源叶生物科技有限公司；DMEM 培养基（生物级）购于青岛捷世康生物科技有限公司；氯化钠等化学试剂均为分析纯，购于天津市凯通化学试剂有限公司。

主要仪器包括：pH 计，STARTER 2100 型，奥豪斯仪器有限公司；电子天平，XY600-2C，常州市幸运电子设备有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101Z，巩义市予华仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9023A，上海精宏试验设备有限公司。

1.2 复合涂层的制备

1.2.1 AZ31 镁合金表面处理

采用规格为15 mm×15 mm×4 mm 和20 mm× 20 mm×4 mm 的挤压态AZ31 镁合金为研究对象，用360#、600#、800#、1000#水磨砂纸对样品进行打磨，以去除表面氧化层，用丙酮清除表面油污，乙醇清洗，吹干备用。

1.2.2 涂层的制备

称取钠化蒙脱石（Na-MMT）溶于去离子水中，制成 Na-MMT 质量分数为 2%的悬浮液，调节pH=10.2，80 ℃下恒温搅拌5 h 后取60 mL 加入水热釜中。将处理好的AZ31 镁合金置于水热釜中保持直立（放入2 块聚四氟乙烯支撑），将其置于130 ℃恒温干燥箱中，36 h 后取出，去离子水清洗，吹干得Na-MMT 涂层。将其浸泡于2.5 g/L 肝素钠溶液（PBS缓冲溶液配成）中，调节pH=7.4，30 min 后取出，用去离子水清洗，吹干得肝素/蒙脱石（HS-MMT）复合涂层，制备流程见图1。

图1 HS-MMT 涂层制备流程图 Fig.1 Schematic illustration of preparation of HS-MMT coating

1.3 HS-MMT 涂层的表征及性能检测

1.3.1 涂层的表征

采用扫描电子显微镜（Nova Nano SEM 450，USA）观察涂层表面、截面形貌及涂层厚度，利用能谱仪（EDS）分析样品组成元素。通过傅里叶红外分析仪（NicoletiS50）测定涂层官能团。采用X-衍射仪（D/MAX-2500PC）表征物相组成。

1.3.2 涂层的耐蚀性测试

1）电化学测试。采用三电极体系，参比电极为饱和甘汞电极（SCE），对电极为铂电极，工作电极为被测样品，腐蚀介质DMEM 溶液的pH 值为7.4，试验温度为室温，测试样品面积与测试溶液体积比为1 cm2/400 mL。动态极化测试时，电位扫描范围相对自腐蚀电位从–350 mV（vs. SCE）到+450 mV（vs. SCE），扫描速度为1 mV/s。

2）析氢试验。用酸式滴定管、玻璃漏斗和烧杯自制析氢装置。按1 cm2/25 mL的面积/溶液比将AZ31镁合金基体和HS-MMT 涂层分别悬浮于DMEM 溶液中，每组3 个平行样。将样品浸泡5 d，每24 h 更新液体，溶液温度保持在(36.5±1) ℃。每1 h 测定1 次样品在腐蚀过程中产生的氢气体积。

2 结果与讨论

2.1 形貌观察及成分分析

Na-MMT、HS-MMT 涂层电镜形貌及EDS 分析见图2。可以看出，低倍镜下Na-MMT 涂层呈颗粒状结构，HS-MMT 涂层除颗粒状外还可观察到片层状结构，未见基体。与Na-MMT 涂层相比，HS-MMT涂层略为致密。从图2b、2e 中可以看出，高倍镜下两种涂层均呈典型的蒙脱石片层状结构，此外图2b、2e 中截面图显示 Na-MMT 涂层厚度为 40 μm，HS-MMT 涂层厚度为41 μm。以上结果表明，水热法成功在AZ31 镁合金表面制备了Na-MMT 涂层和HS-MMT 涂层，且涂层制备过程未对蒙脱石的结构产生影响，保留了蒙脱石的性质。图2c、2f 分别是Na-MMT 和HS-MMT 的EDS 元素分析，两图对比可知，HS-MMT 涂层中除存在O、Na、Mg、Al、Si、C 等Na-MMT 涂层的基本元素外还出现了N、S 元素，说明通过浸泡法Na-MMT 涂层成功吸附了HS，在AZ31 镁合金表面制备了HS-MMT 涂层[21]。

图2 Na-MMT 和HS-MMT 涂层电镜下形貌及EDS 元素分析 Fig.2 SEM morphology and EDS of Na-MMT coating and HS-MMT coating

图3 HS-MMT 涂层的XRD 谱图 Fig.3 XRD patterns of HS-MMT coating

HS-MMT 涂层的XRD 谱图如图3 所示。从图3中可以看出，HS-MMT 涂层与Na-MMT 涂层的图谱 相似，都具有蒙脱石的特征峰，但由于肝素为有机物，XRD 测试无法显示其特征峰。此外，HS-MMT 涂层与Na-MMT 涂层图谱中还出现了Mg、Mg(OH)2的特征峰，说明水热法成功地将Na-MMT 应用于AZ31镁合金表面并形成涂层[33]。

HS-MMT 涂层的FTIR 谱图如图4 所示。图4 中显示HS-MMT 涂层、Na-MMT 与Na-MMT 涂层在1038、1643、3627 cm–1处都出现了蒙脱石特有的吸收带，分别对应于Si—O 伸缩振动、H—O—H 伸缩振动和表面吸附水、层间水及氧化镁引起的Al—O—H基团的伸缩振动。此外，HS-MMT 涂层与Na-MMT涂层在694 cm–1处还出现了Si—O—Mg 的伸缩振动峰，这说明在AZ31 镁合金表面成功制备了涂层[21,33,36]。与Na-MMT、Na-MMT 涂层相比，HS-MMT 涂层在620 cm–1处出现了肝素特有的—SO3H 伸缩振动峰[39]，在1235 cm–1和3417 cm–1处出现了肝素分子中S==O和—NH—的伸缩振动峰[38,40]，这证明在HS-MMT 涂层中存在肝素。

图4 HS-MMT 涂层的FTIR 谱图 Fig.4 FTIR spectrum of HS-MMT coating

2.2 耐蚀性能

所得涂层样品的EIS 表征如图5 所示。样品的容抗弧直径越大，说明其耐蚀性能越好。Nyquist 图显示样品的耐腐蚀性能依次为HS-MMT 涂层>Na-MMT涂层>AZ31 镁合金，这表明HS-MMT 涂层能有效减缓AZ31 镁合金在DMEM 溶液中的腐蚀，提高了其耐腐蚀能力。所得涂层样品的极化曲线如图6 所示，经Tafel 外推法得到的涂层的自腐蚀电位（Ecorr）和腐蚀电流密度（Jcorr）见表1。由结果可知，在极化过程中，AZ31 镁合金的Ecorr最小、Jcorr最大，与其相比，Na-MMT 涂层的 Ecorr增大、Jcorr减小，而HS-MMT 涂层的Ecorr最大、Jcorr最小，这说明HS-MMT涂层具有更好的耐腐蚀性能，与Nyquist 曲线结果一致[41]。

图5 镁合金基体、Na-MMT 和HS-MMT 涂层的Nyquist曲线 Fig.5 Nyquist plots of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

所得涂层样品的析氢速率曲线如图7 所示，从图7 中可以看出，浸泡初期AZ31 镁合金的析氢速率较 大且下降速度较快，大约30 h 后析氢速率降低到较低水平，下降速度也变得缓慢。这可能是由于Cl 离子等腐蚀性离子的腐蚀作用导致AZ31 镁合金在浸泡初期的析氢速率较快，然后由于腐蚀产物Mg(OH)2对AZ31 镁合金产生保护作用[40,42-43]，腐蚀速率大大降低。由图7 可知，Na-MMT 涂层与HS-MMT 涂层的析氢速率变化不大，平均析氢速率分别为0.024、0.016 mL/(cm·h)，说明两种涂层对AZ31 镁合金起到了保护作用，而HS-MMT 涂层的保护作用更明显，这除了与涂层的物理隔离作用有关外[44]，还可能与带负电荷肝素的持续析出有关。

图6 镁合金基体、Na-MMT 和HS-MMT 涂层的极化曲线 Fig.6 Polarization curves of the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

表1 极化曲线的电化学参数 Tab.1 Electrochemical parameters of the polarization curve

图7 镁合金基体、Na-MMT 和HS-MMT 涂层析氢速率 Fig.7 Hydrogen evolution rates as a function of time for the magnesium substrate, Na-MMT and HS-MMT coatings

进一步分析Na-MMT 涂层的形成机理：在碱性条件下，Na-MMT 发生水化反应后，其硅氧四面体表面具有的活性OH–可与镁合金水化反应产生的OH–在水热条件下脱去H2O，形成氧桥，使Na-MMT 与AZ31 镁合金紧密结合，形成Na-MMT 涂层，如图8所示。Na-MMT 与AZ31 镁合金可能发生的化学反应见式(1)—(4)。

蒙脱石发生水化反应：

蒙脱石与NaOH 的反应：

镁合金发生水化反应：

蒙脱石与Mg(OH)2反应：

图8 Na-MMT 涂层制备机理示意图 Fig.8 Schematic illustration of Na-MMT coated Mg alloy AZ31

3 结论

1）采用水热法在AZ31 镁合金表面制备了Na- MMT 涂层，在此基础上通过浸泡法成功制备了致密的HS-MMT 复合涂层。

2）通过电化学试验和析氢速率测定对HS-MMT涂层的耐蚀性能进行研究。结果显示，HS-MMT 涂层的自腐蚀电位（–1.20 V）高于 AZ31 镁合金（–1.49 V），腐蚀电流密度降低了2 个数量级，且其平均析氢速率为0.016 mL/(cm·h)，明显低于AZ31 镁合金的平均析氢速率。这表明AZ31 镁合金HS-MMT涂层具有良好的耐腐蚀性能。