精氨酸功能化磁性纳米材料的制备及在磷酸化肽富集中的应用

郑海娇，姜丽艳，贾 琼

（1.吉林大学化学学院,2.生命科学学院,长春130012）

蛋白质不同的翻译后修饰（PTM）在生命活动调节中发挥着不同作用，据统计迄今已发现超过300种的蛋白质PTM.作为最常见和重要的蛋白质PTM之一，可逆磷酸化修饰一直是研究的热点和重点［1～3］.目前，对磷酸化蛋白或磷酸化肽的鉴定主要依靠生物质谱技术［4，5］.质谱技术虽然发展迅速，但在蛋白质磷酸化的鉴定方面仍面临难题，主要是由于生物体内磷酸化蛋白的表达量很低.样品在未经过前处理的前提下很难消除基质的干扰，实现对低丰度的磷酸化蛋白准确而可靠的质谱（MS）直接检测.因此，发展对磷酸化蛋白或磷酸化肽具有较强捕获能力的富集材料是磷酸化修饰准确鉴定的基础需求.磁性固相萃取（MSPE）是一种常见的前处理技术，被广泛应用于生物分离领域［6，7］.MSPE技术通常选用Fe3O4微球作为载体，在外加磁场的作用下实现溶剂与材料的分离.另外，可以在Fe3O4微球表面修饰特定的功能性基团或物质，以提高材料对目标分析物的捕获能力.目前，已有多种基于不同磷酸化肽富集机理的功能化磁性材料被合成并用于富集样品中目标肽段［8～10］.但是，很多材料仍然不能很好地避免非目标肽段的干扰.因此，发展新型的对磷酸化肽具有高捕获能力、高选择性和高灵敏度的适用于MSPE技术平台的功能化磁性载体材料十分必要.

精氨酸残链中的胍基在含磷酸酯的酶和非催化性蛋白质的活性位中起到重要作用［11，12］.精氨酸（Arg）分子中的胍基与磷酸基之间存在一种类似共价键的静电相互作用，可形成“高能磷酸键”N—P键，并且精氨酸边链上的胍基与磷酸基更容易产生稳定的相互作用，形成更强的盐桥连接.此外，胍基和磷酸基之间还存在稳定的氢键相互作用，处于平面结构的胍基可与磷酸根的每个氧原子分别成键，胍基独具的两性强氢键结构也是专一选择性的保证［13，14］.本文利用水热法合成Fe3O4微球，以硅酸四乙酯（TEOS）对其进行包覆后，再以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对硅烷化的磁性微球进行第一步后修饰，使磁性微球表面带有氨基；然后通过简单的交联反应将Arg包覆到氨基化的磁性微球上，得到Arg功能化的磁性材料（简称Mag-Arg）.实验涉及的有机合成步骤简单且产率高，合成材料具有成本低、易制备、耗时短等优点.并以标准磷酸化蛋白酶解产物作为研究模型建立MSPE-MS平台，考察了Mag-Arg材料对目标分析物的富集能力和方法的应用性.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SU8020型冷场场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS ZEN3600型纳米粒度仪和Zeta电位分析仪（英国Malvern公司）；SQUID-VSM型磁学性能测试系统（美国Quantum Design公司）；Nicolet is5型傅里叶变换红外光谱仪（德国Bruker公司）；X射线衍射仪（荷兰PANalytical B.V.公司）；AB Sciex 5800型飞行时间质谱仪（美国AB SCIEX公司）；Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore公司）.

三氟乙酸（TFA，98%）、硅酸四乙酯（TEOS，99%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）、碳酸氢铵（NH4HCO3，99%）、乙腈（ACN，98%）、2，5-二羟基苯甲酸（DHB，98%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，97%）、1-羟基苯并三唑（HOBT，97%）、β-酪蛋白（β-casein，≥98%）、胰蛋白酶（Trypsin）、卵清白蛋白（OVA，≥98%）、牛血清蛋白（BSA，≥98%）、精氨酸（Arg，≥95%）、二硫苏糖醇（DTT，99%）、碘乙酰胺（IAA，99%）、N，N-二异丙基乙胺（DIPEA，99%）和甲酸（99%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化铁（FeCl3·6H2O，98%）、乙二醇（EG，99%）、醋酸钠（NaAc，99%）、氨水（NH3·H2O，25%）、磷酸（H3PO4，85%）、醋酸（HAc，96%）、尿素（99%）、乙醇（≥98%）和甲醇（≥98%）购于北京化学试剂公司.实验用水均为Milli-Q超纯水仪制备的高纯水.

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理 标准样品的处理：称取1 mgβ-casein或OVA冻干粉标准品溶解于1 mL NH4HCO3缓冲溶液（50 mmol/L）中，在100℃金属浴中加热10 min使蛋白质发生热变性.随后冷却至室温，加入1 mg/mL的Trypsin［m（β-casein）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h.待样品溶液冷却至室温后，加入2μL甲酸终止酶解反应.称取1 mg BSA冻干粉标准品溶解于含有8 mol/L尿素的1 mL NH4HCO3缓冲溶液（50 mmol/L）中，混合均匀后在室温下静置1 h.加入100μL DTT（1 mol/L），在60℃下加热1 h，冷却至室温，随后加入37 mg IAA，室温下避光反应45 min.经还原及烷基化处理后的蛋白质用NH4HCO3缓冲溶液（50 mmol/L）稀释，直至其中尿素浓度小于1 mol/L后，加入1 mg/mL Trypsin［m（BSA）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h，加入甲酸终止反应.将制备的酶解液保存于-20℃冰箱中备用［15，16］.

实际样品的处理：在1 mL脱脂牛奶中加入5倍量的NH4HCO3缓冲溶液（25 mmol/L），在3500g的离心力下离心20 min，取上层清液，在100℃金属浴中保持10 min后，冷却至室温.加入1 mg/mL Trypsin［m（底物）∶m（Trypsin）=50∶1］，在37℃水浴中酶解16～18 h，加入甲酸终止反应.用NH4HCO3缓冲溶液（25 mmol/L）稀释，以备后续分析［17］.

1.2.2 Mag-Arg材料的合成 称取1.35 g FeCl3·6H2O溶于75 mL EG中，搅拌均匀后加入3.60 g NaAc，继续搅拌至产生黄色黏稠溶液.将混合液移至高压水热反应釜中，在200℃下加热16 h.产物依次用乙醇和纯水分别冲洗3次，经磁吸分离得到Fe3O4微球［18］.称取350 mg Fe3O4微球均匀分散于含220 mL乙醇、55 mL水和1.4 mL NH3·H2O（质量分数25%）的混合溶剂中，向混合液中加入1 mL TEOS，室温下搅拌12 h，经磁吸分离得到硅烷化的磁性微球（简称Mag-TEOS）.取100 mg Mag-TEOS分散到30 mL乙醇中，加入1.3 mL APTES，室温下搅拌1 h，经磁吸分离得到氨基化的磁性微球（简称Mag-APTES）［19，20］.称取100 mg Arg，345 mg EDC和243 mg HOBT，依次加入到10 mL DMF和400μL DIPEA混合溶液中，混合均匀后加入Mag-APTES，室温下搅拌24 h.依次用DMF和高纯水清洗产物，经磁吸分离得到终产物—Arg修饰的磁性微球（简称Mag-Arg）.

1.2.3 MSPE富集磷酸化肽 称取5 mg Mag-Arg，用1 mL水和1 mL溶剂A（50% ACN+0.1 mol/L HAc）分别洗涤3次，再将其分散在1 mL溶剂A中备用.实验采用典型的MSPE前处理步骤，依次为上样、清洗和解吸.首先，取20μL上述样品储备液加入到100μL样品溶液中（所需的不同浓度的样品均用溶剂A进行稀释），在室温下振荡45 min后，经磁吸分离样品与材料.除去溶剂后，每次用100μL溶剂A对样品反复洗涤3次，以去除非磷酸化肽段.最后，向清洗过的样品中加入30μL溶剂B（50% ACN+2% TFA），于室温下振荡20 min，经磁吸分离材料并收集洗脱液以用于后续分析.

1.2.4 MALDI-TOF MS的质谱条件 样品测试采用AB Sciex 5800型飞行时间质谱仪，选用正离子模式，基质采用含25 mg/mL DHB的70% ACN+1% H3PO4溶液.测试前，取待测样品与DHB基质溶液各0.5μL，混合均匀后滴于质谱仪的靶板表面.质谱仪的其它参数设置如下：离子源温度110℃；电喷雾电压2.3 kV；扫描范围m/z1000～3500；毛细管电压3500 V；碰撞解离能量10 eV.

2 结果与讨论

2.1 Mag-Arg的合成与表征

Mag-Arg的合成及萃取流程如图1所示.通过SEM表征了制备的Fe3O4微球和Mag-Arg的形貌和尺寸.如图2（A）所示，Fe3O4微球呈规则的球状形貌，但微球存在聚集现象；如图2（B）所示，对Fe3O4微球进行修饰，可有效降低粒子间的磁性偶极吸引，使磁性微球的分散性更好.

Fig.1 Synthetic route of Mag-Arg(A)and workflow of phosphopeptides enrichment by Mag-Arg(B)

Fig.2 SEM images of Fe3O4(A)and Mag-Arg(B)

对Fe3O4微球和Mag-Arg进行了粒度分析（DLS）和Zeta电位测试，结果表明，制备的Fe3O4微球和Mag-Arg在水溶液中的尺寸分别集中在（550±2.5）nm和（560±2.0）nm，此结果SEM结果基本吻合.图3（A）示出了pH=7.4条件下测得的粒子的表面电性.Fe3O4微球表面的多羟基使其Zeta电位为负值；与之对比，Mag-Arg表面修饰的Arg富含游离的氨基，质子化后表面带正电荷，有利于与带负电荷的磷酸根结合，这验证了材料的吸附机理.图3（B）为Fe3O4微球和Mag-Arg的振动样品磁强计（VSM）曲线，可见修饰前/后的微球均表现出明显的超顺磁性，不存在剩磁、磁滞和矫顽磁力现象.修饰前/后磁性微球的饱和磁通量分别为77.8和63.9 A·m2·kg-1，均达到磁性分离要求.图3（B）中插图表明在外界磁场作用下，Mag-Arg可以在约30 s的时间内迅速地与溶液分离.

Fig.3 Zeta potentials(A)and VSM curves(B)of Fe3O4(a)and Mag-Arg(b),FTIR spectra(C)and XRD patterns(D)of Mag-TEOS(a),Mag-APTES(b)and Mag-Arg(c)

采用红外光谱（FTIR）对Mag-Arg及中间产物Mag-APTES和Mag-TEOS进行了表征.由图3（C）可见，Mag-Arg，Mag-APTES及Mag-TEOS在1080和789 cm-1处均有相似的特征吸收峰，分别归属于Fe—O键的弯曲振动、Si—O—Si键的不对称伸缩振动和Si—O键的弯曲振动，说明Fe3O4微球已被硅烷化.与图3（C）谱线a相比，谱线b在3479和1565 cm-1处出现归属于N—H的特征吸收峰，同时，1299 cm-1处出现C—N伸缩振动吸收峰，证实APTES已成功修饰.与图3（C）谱线b相比，谱线c中增加了1181 cm-1处的吸收峰，归属于Arg中C=N的伸缩振动，说明Mag-Arg已成功制备.另外，采用X射线衍射分析对Mag-Arg，Mag-APTES及Mag-TEOS的晶体结构进行了表征.由图3（D）可见，3种材料均出现6个明显的衍射峰（2θ=30.3°，35.6°，43.4°，53.6°，57.3°，63.0°）.对比JCPDS粉末衍射标准联合委员会磁铁数据库中的数据发现，这些衍射峰完全匹配Fe3O4微球的（220），（311），（400），（422），（511）和（440）晶面，说明材料的有机合成过程没有破坏Fe3O4微球的晶格结构.

2.2 Mag-Arg对磷酸化肽的富集能力

以Trypsin酶解的20 pmolβ-casein产生的磷酸化肽为标准样品，考察了Mag-Arg对磷酸化肽的富集能力.由于在不同酸度条件下，吸附剂对磷酸化肽的吸附选择性会随之改变，本实验采用控制单一变量法，分别优化样品缓冲液和洗脱液的酸度.选取样品缓冲液中HAc浓度分别为0.01，0.1和1 mol/L进行实验，结果如图4（A）和（B）所示，当样品缓冲液中HAc浓度为0.01 mol/L时，多磷酸化肽的信号弱；当HAc浓度为1 mol/L时，单磷酸化肽的信号弱，且质谱图中杂峰多.选取洗脱液中TFA的体积分数分别为2%，4%和6%进行实验发现，当TFA体积分数为4%和6%时，多磷酸化肽的信号增强，但单磷酸化肽的富集能力欠佳［图4（C）和（D）］.最终，确定溶剂A（50% ACN+0.1 mol/L HAc）和溶剂B（50% ACN+2% TFA）为最佳的缓冲液和解吸液组合.

在最佳实验条件下，对比了直接质谱分析与经Mag-Arg富集后磷酸化肽的质谱图.如图5（A）所示，在相同的质谱条件下，直接分析所得质谱图中未见磷酸化肽的信号峰，主要由于样品溶液中存在高丰度的非磷酸化肽导致.如图5（B）所示，经Mag-Arg富集后磷酸化肽的信号峰十分明显，背景干净，杂峰极少，说明Mag-Arg对磷酸化肽具有较高捕获能力，能有效屏蔽样品中非磷酸化肽的干扰.富集到的磷酸化肽的详细信息见表1.为了对比Mag-Arg，Mag-APTES和Mag-TEOS对磷酸化肽富集的效果，将Mag-APTES和Mag-TEOS也分别用于相同β-casein酶解液中磷酸化肽的富集.如图5（C）和（D）所示，Mag-TEOS未捕获到磷酸化肽，而Mag-APTES仅捕获到1条磷酸化肽（m/z2061.4），表明Arg的后修饰显著提高了材料对磷酸化肽的捕获能力.

Fig.4 MALDI mass spectra ofβ-casein digests at different acidity conditions

Fig.5 MALDI mass spectra ofβ-casein digests

Table 1 Detailed information of the observed phosphopeptides obtained fromβ-casein tryptic digests enriched by Mag-Arg after different times

为了考察材料的重复利用性，选用20 pmolβ-casein酶解液作为标准品，在相同实验条件下，将材料第1次、第7次和第14次富集后的结果进行对比发现，该材料在重复使用14次后仍保持对磷酸化肽的高富集能力，如表1所示，所富集到的目标肽段的数量与第1次使用时无差.为了考察所建立的基于Mag-Arg的MSPE-MALDI-TOF MS方法的灵敏度，将β-casein标准品分别稀释至50，5，0.5和0.1 fmol用于检测.由图6可见，当样品浓度稀释至0.1 fmol时，仍能检测到2条磷酸化肽（m/z2061.6和2556.7），表明本方法对磷酸化肽检测具有较高的灵敏度.

Fig.6 MALDI MS spectrum of 0.1 fmolβ-casein digests after enrichment by Mag-Arg

2.3 复杂样品的分析

为了考察所建立方法对磷酸化肽的选择性，将2种标准磷酸化蛋白β-casein和OVA与典型的非磷酸化蛋白BSA按摩尔比1∶2000∶2000混合作为复杂样品.质谱分析结果表明，在直接分析所得质谱图中未观察到磷酸化肽的信号峰［图7（A）］；而在经Mag-Arg富集后的质谱图［图7（B）］中，非磷酸化肽的信号被显著抑制，出现6条明显的磷酸化肽的信号峰和1条去磷酸化肽信号峰，说明Mag-Arg在复杂样品中对磷酸化肽具有较高的选择性.富集到的磷酸化肽的详细信息见表2.

Fig.7 MALDI MS spectra of composite samples(A,B)and nonfat milk samples(C,D)

Table 2 Detailed information of the observed phosphopeptides obtained from composite samples and nonfat milk samples enriched by Mag-Arg

为了验证所制备材料在实际生物样品分析中的富集效果，选择处理过的脱脂牛奶（均购于本地超市）为实际样品，富集条件与富集标准样品时的相同.由于牛奶中含有大量的蛋白质，其中磷酸化蛋白含量较低，在未经富集的质谱图中，背景复杂，非目标肽段干扰大，几乎检测不到磷酸化肽［图7（C）］；与之相比，经Mag-Arg富集后，可以检测到14条磷酸化肽［图7（D）］，其中包括6条单磷酸化肽和8条多磷酸化肽.富集到的磷酸化肽的详细信息见表2.同时，在图7（D）中可以观察到非磷酸化肽的信号丰度相对较弱，说明所制备的Mag-Arg具备应用于实际样品分析的能力.对比文献［17，21～25］报道的基于胍基材料富集磷酸化肽的方法（见表3），本文方法检出限较低，在复合样品和实际牛奶样品中对磷酸化肽的选择性均较高.

Table 3 Comparison of the determination of phosphopeptides based on different materials

3 结 论

制备了精氨酸功能化的磁性微球吸附剂，通过SEM，DLS，VSM，FTIR和XRD对其进行了表征.结果表明，Mag-Arg的结构均匀且分散性良好，其平均粒径约为560 nm，具有晶型结构稳定、磁感应强等优点，其饱和磁化强度高达63.9 A·m2·kg-1.制备的Mag-Arg表面富含大量的带正电荷的胍基，与溶液中呈负电性的磷酸根之间存在较强的相互作用，适用于高选择性捕获磷酸化肽.将Mag-Arg应用于MSPE前处理技术，以标准磷酸化蛋白的酶解产物作为样品，结合MALDI-TOF MS平台，成功捕获到样品中磷酸化肽的信号峰，且方法的检出限低至0.1 fmol，证明方法具有较高的灵敏度.最后，将建立的基于Mag-Arg和MSPE-MS的联用方法用于复杂样品和牛奶样品中磷酸化肽的分析，均取得了较好结果，证明该方法具有较高的选择性和适用于实际样品分析的能力.