DAPK-1与p62/SQSTM1在早发型重度子痫前期患者胎盘组织中表达及临床意义

周娇娇 薛秀珍

河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院(洛阳，471003)

子痫前期(PE)属于一种妊娠期高血压疾病，临床主要表现为妊娠20周后出现高血压、蛋白尿及全身器官功能损害，可引起胎儿宫内缺氧和生长受限，是导致孕妇和胎儿死亡的主要原因，世界范围内发病率为3%～5%[1-2]。根据症状出现时孕周，以孕周34周为界限分为早发型PE、晚发型PE。PE是一种妊娠特异性疾病，发病机制及病因均不清楚，目前研究认为，炎症和氧化应激是胎盘自噬改变的潜在刺激因素，会引起胎盘功能障碍和妊娠病理。DAPK-1和P62/SQSTM1均属于自噬调节因子，其在PE以自噬的形式发挥着特殊的影响，对生殖功能具有重要的调控作用。DAPK-1属于细胞死亡和自噬的调节因子[3]，是胎盘组织中广泛存在的一种分子。在线生物全球定位系统(Bio GPS)显示，DAPK-1在胎盘中的表达水平是其他任何人类细胞或组织的3.5倍。P62/SQSTM1是一种自噬降解的底物，在PE胎盘活检样本的绒毛外滋养层细胞(EVTs)中积累，在体内表现为自噬受损[4]，因此自噬状态在PE胎盘中出现改变，并且越来越多的研究表明自噬参与妊娠。本研究通过检测PE胎盘组织中DAPK-1、P62/SQSTM1的表达情况及两者相关性研究，探讨早发型重度PE的病理生理机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年12月—2015年10月本院病理科66例PE和30例正常孕妇胎盘组织石蜡标本，其中早发重度PE 26例，晚发重度PE 40例，排除：①多胎妊娠、羊水异常、胎儿畸形、胎盘早剥、胎儿宫内窘迫、发育迟缓患者；②先天性疾病、其他原发疾病及心血管疾病等合并症及并发症；③合并其他产科并发症及其他内科合并症者；④孕期无急、慢性感染性疾病，无烟酒等不良嗜好。诊断标准根据《妇产科学》第9版标准。本研究通过本院伦理委员会审查，且所有参与者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1SABC法染色(试剂盒均为博士德产品)石蜡标本4μm切片。兔抗人DAPK-1多克隆抗体、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗体。经过脱蜡、水化、高压热修复；3%的H2O2去离子水室温孵育10min，PBS冲洗4次(5min/次)；加入5%山羊血清，37℃孵育30min，甩干，直接滴加兔抗人DAPK-1多克隆抗体、兔抗人p62/SQSTM1多克隆抗体，4℃过夜；放置室温用PBS冲洗4次(5min/次)；滴加生物素标记山羊抗兔IgG,37℃孵育30min，PBS冲洗4次(5min/次)；滴加SABC，37℃孵育30min，PBS冲洗4次(5min/次)；室温下进行显微镜下显色剂着色10min，蒸馏水充分洗涤后以终止反应，再依次以通过苏木素复染40s，分化液2s，蓝化液2min，再蒸馏水冲洗3min后，通过梯度乙醇脱水和二甲苯的透明化，中性树胶固定封片，最后在显微镜下观察，出现棕黄(褐)色视为阳性染色。

1.2.2结果判定任意选取5个高倍镜视野，阳性细胞占比<25%，1分；≥25%～<50%，2分；≥50%～<75%，3分；≥75%，4分。染色强度：无着色,0分;浅黄色,2分;棕黄色,3分;棕褐色,4分。阳性细胞占比与染色强度之和进行评估：0～1分，阴性(-)；2～3分，弱阳性(+)；4～5分，中度阳性(++)；>5分，强阳性(+++)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

早发重度PE患者年龄(30.9±5.6)岁，孕周(37.5±1.6)周；<34孕周正常孕妇10例作为其对照组，年龄(27.6±4.0)岁，孕周(38.6±1.8)周；两组差异均无统计学意义(P均>0.05)。晚发型发重度PE患者年龄(27.5±6.0)岁，孕周(37.5±1.6)周；>34孕周正常孕妇20例为对其照组，年龄(28.4±4.4)岁，孕周(38.6±1.8)周。两组差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 DAPK-1、p62/SQSTM1的表达情况

SABC法检测显示DAPK-1阳性颗粒为棕褐色，主要表达于绒毛滋养细胞的胞浆；p62/SQSTM1阳性颗粒为棕褐色，表达在绒毛滋养细胞的胞浆。DAPK-1在早发型重度PE组的阳性表达较对照组和晚发型重度PE组均高(χ2=26.816，P<0.05；χ2=11.510，P<0.05)；DAPK-1在晚发型重度PE组的阳性表达高于对照组(χ2=6.076，P<0.05)。p62/SQSTM1 在早发型重度PE组的阳性表达低于对照组和晚发型重度PE组(χ2=18.379，P<0.05；χ2=5.442，P<0.05)；晚发型重度PE阳性表达低于对照组(χ2=6.076，P<0.05)。见图1(2252页)、表1。

表1 各组胎盘组织中DAPK-1、p62/SQSTM1的阳性表达比较[例(%)]

2.3 胎盘组织中DAPK-1与p62/SQSTM1相关性分析

DAPK-1和p62/SQSTM1在PE胎盘组织中的表达水平呈负相关(r=-0.505，P<0.05)。

3 讨论

PE是一种多因素、多机制及多通路致病的疾病，目前研究认为，EVTs深入侵犯子宫螺旋动脉，破坏肌层和弹力层，取代血管内皮细胞，这使螺旋动脉扩张并且引起子宫胎盘血流量增加，因此，如果此阶段过程失败导致子宫胎盘血流减少，并且低氧应激会影响胎盘异常形成[5]。关于早发EP的病因假说主要是基于EP滋养层浸润浅，胎盘发育不良。研究发现，自噬与妊娠高血压发病过程中的滋养细胞功能受损、母胎免疫反应失衡、子宫螺旋动脉重铸不良、血管内皮细胞损伤和氧化损伤等有密切关系[5-6]。

研究发现，DAPK-1是一种自噬分子，在暴露于炎症刺激的妊娠早期胎盘外植体中显著下调[7]。DAPK-1 是凋亡的正性调节因子，参与多种信号通路，调节细胞凋亡、自噬、细胞黏附和迁移。女性妊娠时存在胎盘组织滋养细胞凋亡过度 , 影响滋养细胞侵入、子宫螺旋动脉重铸不足，导致“胎盘浅着床”，使胎盘血液灌注量减少 , 导致 PE的发生。据已知相关类似蛋白的研究得知，DAPK-1可能主要表达在合体滋养细胞胞质中，而低氧胎盘组织中的表达水平高于常氧胎盘组织[8]。自噬过度激活时，胎盘滋养细胞释放的部分物质可诱导母体发生免疫反应，从而使其可释放一些炎性介质(如TNF-α)可与DAPK-1共同促进细胞凋亡、自噬和程序性坏死[9]。本实验采用免疫组化SABC法检测DAPK-1在正常、早发型重度PE、晚发型重度PE胎盘中的表达，结果显示DAPK-1在3组胎盘绒毛合体滋养细胞层中均表达，但DAPK-1的表达随着PE疾病的严重程度而增加，与既往研究结果，DAPK-1的mRNA蛋白表达在EP的妊娠胎盘中升高，提示致病因子的来源可能为胎盘相符合[10]。DAPK-1的表达增高限制滋养细胞凋亡、滋养细胞浸润等致使胎盘浅着床等可能是引起早发型重度PE的原因。

P62是一种在人类和动物细胞中的应力诱导的细胞蛋白，是氨基酸感应和氧化应激反应的信号中枢[11]。p62作为泛素化底物降解的选择性自噬受体，是mTORC1通路的积极调节因子，属于细胞自噬和mTORC1通路，是细胞信号转导网络，可控制细胞生长和增殖，加速对环境线索的反应[12-13]。自噬是p62降解的原因，因此当自噬异常损伤导致p62大量的积累，进而形成p62阳性聚集结构和泛素[14]。在早发型子痫患者胎盘中，与正常妊娠胎盘相比，高血压患者胎盘中的自噬激活蛋白LC3-II增加，p62减少[15]。为探讨了解引起早发型重度PE的发病机制，本研究采用免疫组化法检测p62/SQSTM1在正常组、晚发重度PE组、早发重度PE组胎盘中的表达情况，结果显示，p62/SQSTM1在正常组胎盘中表达最强(P<0.05)，这同潘耀平等[16]研究结果一致，提示p62/SQSTM1可能参与早发型重度PE的病理过程，且胎盘中p62/SQSTM1的表达水平与PE的疾病严重程度密切相关。

本研究结果还显示：p62/SQSTM1与DAPK-1在PE胎盘组织的表达水平呈显著负相关联，表明其在PE的发展中起协同作用，共同参与早发型重度PE的发生与发展过程。自噬是p62降解的原因，因此当自噬异常损伤会导致p62大量的积累，进而形成p62阳性聚集结构和泛素[17]；促炎细胞因子白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)能够影响自噬基因的编导谱，自噬的PCR 阵列分别在胎盘外植体中响应IL-6和TNF-α，显著下调DAPK-1的水平[18]。当滋养细胞中DAPK1 mRNA和蛋白减少时，自噬激活蛋白LC3B-I和-II增加，进而使自噬相关蛋白p62减少。当存在胎盘组织滋养细胞凋亡过度时, 会影响滋养细胞侵入、子宫螺旋小动脉重铸不足，导致“胎盘浅着床”，使胎盘血液灌注量减少 ,导致子宫螺旋小动脉血管发生血管重铸不良，可能会进一步致胎盘缺氧。胎盘缺氧可致使血管内皮细胞损伤，炎症介质的释放以及抗凝物质的聚集，引起的螺旋动脉粥样硬化，血管内微血栓的形成，进一步加重、促进炎症反应，加重细胞内皮损伤，导致EP的发生与疾病的进展。DAPK1是一种凋亡与自噬的调节剂，DAPK-1与P62共同参与PE的疾病进展。DAPK-1表达增多，细胞凋亡机制受到激活，大量破碎的坏死滋养细胞增多，引发细胞自噬效应，可致P62参与的自噬过程激活，自噬体与溶酶体融合，细胞内的P62等蛋白质或细胞器被降解，释放的部分物质可诱导母体发生免疫反应，可能刺激其靶细胞释放促炎细胞因子白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性细胞因子可与DAPK-1进入母体的血液循环；以及同降解的破碎的细胞器或蛋白进入母体血液循环，致使血管内皮细胞损伤，诱发全身炎症免疫反应过度激活现象，全身小动脉的痉挛，从而螺旋动脉的绒毛外滋养细胞的浸润能力受损和子宫螺旋小动脉重铸极其不足，使胎盘血液灌注量减少，导致“胎盘浅着床”，引发PE。

综上，本研究的结果表明早发型重度PE胎盘中DAPK-1表达高、P62表达低，提示早发型重度PE的疾病严重程度更重，可能两者共同参与了早发型重度PE的发生与发展；此外它们之间呈负相关联系，可能在早发型重度PE的发病中起相互作用。