基于AB-8 大孔吸附树脂制备余甘子果实精制物及其在卷烟中的应用

叶 烨，李东亮，耿宗泽，杜树山，徐 恒*

1. 四川中烟工业有限责任公司技术中心，成都市锦江区成龙大道1 段56 号 610066

2. 北京师范大学中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京市海淀区新街口外大街19 号 100875

卷烟添加天然植物香原料，是发展“中式卷烟”的措施之一，通过赋予卷烟不同的香气与吸味，可以实现卷烟产品风格多样化，并改善卷烟感官舒适性［1-3］。然而天然香原料成分复杂，在添加天然香原料有效成分的同时也会引入一些影响卷烟抽吸评价的物质，对天然香原料粗提物进行精细加工，可以有效解决该问题［4-6］。

余甘子（Phyllanthus emblicaLinn.），别称庵婆罗、滇橄榄、油甘子等，为大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）植物［7］，因其果实初食酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。我国将其列入既是食品又是药品的两用植物名单［8-9］。余甘子果实可新鲜食用或加工成食品，在我国四川、广东和云南等地饮用余甘子茶，可有效缓解消化不良［10-11］。余甘子果实不仅富含17 种人体所需氨基酸及维生素、多酚、类黄酮和糖类成分，也含有没食子酸、黏液酸、苹果酸和绿原酸等多种有机酸成分［12-16］。有机酸在卷烟上的作用主要是增加烟气的酸性、提高烟气浓度，使烟气醇和，增加甜润感和提高舒适性，在烟用香料的功能成分中占有重要位置［17］。但是余甘子果实提取物因含有果胶、鞣质、蛋白质等成分，直接添加应用在卷烟上，会产生烧灼气息和一定程度的口腔涩感，导致卷烟感官评价不佳。因此，本项目中主要研究利用AB-8 型大孔吸附树脂对余甘子果实提取物进行精制加工，并评价精制物在卷烟中的应用效果，旨在开发天然植物香原料余甘子果实的精制工艺，为余甘子果实精制物的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

市售2018 年云南产余甘子干燥果实；空白卷烟（四川中烟工业有限责任公司）。

没食子酸（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇（AR，成都科龙化工有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；AB-8 大孔树脂（AR，上海麦克林生化科技有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

Acquity UPLC H-Class 超高效液相色谱仪，配PDA 检测器（美国Waters 公司）；1290 Infinity 超高效液相色谱仪，配DAD 检测器（美国Agilent Technologies 公司）；R-210 型旋转蒸发仪（瑞士Büchi 公 司）；Milli-Q Direct 8 纯 水 仪（美 国Millipore 公司）；SCIENTZ-10N 冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Avanti JXN-26 离心机（美国Beckman Coulter 公司）；MS 204S 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；0.22 μm 微孔过滤器（天津津腾实验设备有限公司）；LDP-400A 型粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；孔径0.15 mm（100 目）标准分样筛（浙江上虞市华丰五金仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附树脂的活化处理

取AB-8 型大孔树脂，用95%（体积分数）乙醇浸泡过夜，过滤，用蒸馏水洗涤树脂至无乙醇气味。将醇洗后的大孔树脂先用4 倍柱体积的5%（质量分数）盐酸溶液浸泡4 h，然后用蒸馏水洗至流出液pH 为中性；再用3% NaOH 溶液浸泡4 h，最后用蒸馏水洗至流出液pH 为中性。

1.2.2 余甘子果实粗提物的制备

称取3 份余甘子干燥果实各10.0 g，经粉碎机粉碎后，过分样筛，按照1∶10 的料液比（质量比），分别加入纯水、50%和90%乙醇溶液，加热回流提取3 次，每次1 h。分别合并3 次的提取液，浴温50 ℃、体系压力0.08 MPa 条件下减压浓缩至无乙醇气味，分别冷冻干燥后得粗提物。

1.2.3 利用AB-8 型大孔吸附树脂精制余甘子果实提取物

称取50.0 g 干燥余甘子果实，按1.2.2 节的方法得到20.37 g 余甘子果实粗提物，加入4 倍量（质量比）95%乙醇，静置醇沉24 h，以10 000 转/min 离心10 min；取上清液浓缩至无乙醇气味，得到除去多糖的余甘子果实粗提物9.45 g，标记为A。

称取500 g 1.2.1 节中活化后的AB-8 型大孔吸附树脂（原料∶填料=1∶10，质量比）装入色谱柱（5cm×70 cm），然后将除去多糖的余甘子果实粗提物用少量蒸馏水溶解，再上样至色谱柱，控制样品溶液流速约为5 mL/min，过夜吸附。吸附结束后，依次用纯水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇和95%乙醇溶液以10 mL/min 的流速洗脱，收集各个部分洗脱液后，在浴温50 ℃、体系压力0.08 MPa 下减压浓缩至干，所得各流份（精制物）分别标记为A1、A2、A3、A4 和A5。

1.2.4 标准品的配制

精密称取200 mg 没食子酸（精确至0.1 mg），置于100 mL 棕色容量瓶中，用20%乙醇溶解并定容，配制2 mg/mL 标准溶液；精密移取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL 分别置于10 mL 容量瓶中并定容，得系列没食子酸对照品溶液。

1.2.5 供试样品溶液的配制

称取经冷冻干燥的余甘子果实纯水粗提物、除去多糖的余甘子果实粗提物和余甘子果实精制物（A1）各250 mg（精确至0.1 mg），用20%乙醇溶解并定容至25 mL，配制10 mg/mL 供试样品溶液，经微孔过滤器过滤后，装入2 mL 液相色谱瓶。

1.2.6 余甘子果实提取物的HPLC 分析

参考文献［15，18］中的方法进行HPLC 分析。将纯水、50%乙醇和90%乙醇余甘子果实提取液使用Acquity UPLC H-Class 超高液相色谱仪进行分析（方法1）：ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：乙腈和水（含0.1%甲酸），流速0.2 mL/min；洗脱条件：0～5 min 5%乙腈，5～15 min 5%～30%乙腈，15～20 min 30%～95%乙腈；检测波长：273 nm；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

余甘子果实粗提物及没食子酸的定量分析使用1290 Infinity 超高液相色谱仪进行（方法2）：ACQUITY UPLC HSS PFP 色 谱 柱（1.8 μ m，2.1mm×100 mm）；流动相：乙腈和水（含0.1%甲酸），流速0.2 ml/min；洗脱条件：0～2.5 min 无乙腈，2.5～3.0 min 0～6%乙腈，3.0～7.0 min 6%乙腈，7.0～9.0 min 6%～20%乙腈，9.0～13.0 min 20%～40%乙腈，13.0～14.0 min 60%～95%乙腈，14.0～16.0 min 95%乙腈；检测波长：273 nm；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

1.2.7 卷烟感官作用评价

用10%乙醇溶液配制质量分数为2%的待评价样品溶液，分别向每支空白卷烟中注射2.0 μL待评价样品溶液，对照组为注射等量的10%乙醇。将加香后的样品烟支和对照组烟支分别置于温度（22±2）℃和相对湿度（60±3）%的环境下平衡48 h。由7 名通过中国烟草总公司专业资质认证的卷烟感官评吸专家参照YC/T 496—2014［19］的方法进行感官评价。

2 结果与讨论

2.1 不同余甘子果实提取物比较

提取溶剂对天然产物提取物中化学成分的种类和质量分数有决定性影响，提取物在卷烟中应用的感官评价效果也不同。本研究中先考察了不同溶剂对余甘子果实提取物得率和卷烟应用效果的影响。对不同溶剂提取的余甘子果实提取物进行HPLC 分析的结果如图1 所示，可知：图1a 中余甘子果实的纯水提取物中的化学成分种类较少，主要成分明显，液相色谱保留时间集中在1～4 min内；图1b 中50%乙醇提取物中的化学成分种类增多，液相色谱保留时间在1～2 min 内的成分的质量分数高于保留时间在2～5 min 内的成分；90%乙醇提取物中的化学成分种类最多，液相色谱保留时间在1～5 min 内成分的响应值明显低于前两种提取物，而保留时间在17～19 min 内的成分显著高于前两种提取物。分析HPLC 谱图可知，3 种不同溶剂余甘子果实提取物中化学成分差异明显。3 种提取物的卷烟应用感官评价结果表明：纯水和50%乙醇提取物对卷烟烟气表现出不同程度的改善作用，烟气更柔和、细腻，润甜感增加，刺激性降低，纯水提取物表现更佳；90%乙醇提取物未表现出对感官舒适性的改善作用，且表现出与卷烟烟气不谐调。3 种余甘子果实提取物的提取得率：纯水＞50%乙醇＞90%乙醇（表1）。综上所述，优选纯水为提取溶剂制备余甘子香原料。

表1 不同溶剂余甘子果实提取物的提取得率Tab.1 Extraction rates of Phyllanthus emblica fruits by different extraction solvents

2.2 用大孔吸附树脂对余甘子果实提取物的精制

由于余甘子果实粗提物中含有大量的多糖、果胶、淀粉等大分子成分，将提取液浓缩时易析出难溶物；在用大孔吸附树脂精制粗提物时，纯水洗脱易出现浑浊现象，且层析柱中出现大量絮状物，影响精制效果。因此采用水提醇沉的方法使多糖等大分子物质沉淀析出，得到除去多糖的余甘子果实粗提物。余甘子果实多糖成分的精制加工及在卷烟上的应用，本研究中暂不关注。

各梯度洗脱液经浓缩至干后的质量见表2，结果表明：纯水、不同浓度的乙醇洗脱流份的得率为纯水＞10%乙醇＞30%乙醇＞95%乙醇＞50%乙醇，色泽由淡黄色向深褐色转变。不同浓度乙醇洗脱流份的HPLC 指纹图谱见图2，可知：纯水洗脱流份的化学成分种类较少，其保留时间主要集中在2～3 min 与5～6 min 区间，且洗脱流份干物质得率高达65.9%，主要酚酸成分为没食子酸［15］。10%乙醇洗脱流份的保留时间主要集中在6～8 min 区间，没食子酸仍为主要成分，同时含有较多的未知成分。30%、50%和95%乙醇洗脱流份的成分主要集中在保留时间10～14 min 区间，是一些极性相对小的鞣质成分［18，20］。以上结果表明，AB-8 型大孔吸附树脂可以很好地富集余甘子果实提取物中的没食子酸等简单酚酸类成分。根据各流份的卷烟感官评吸结果（表3）可知，添加纯水洗脱流份的卷烟样品对烟气修饰作用明显，可增加润甜感，改善抽吸时的舒适感；而添加10%、30%和50%乙醇洗脱流份的卷烟样品则表现出不同程度的负面作用，例如对口腔的刺激性，对烟气无改善效果；添加95%乙醇洗脱流份的卷烟样品刺激性降低，但有杂气产生，与烟气不谐调。综上所述，对卷烟感官起正面作用的有效成分主要存在于纯水洗脱流份中，因此将纯水洗脱流份优选为余甘子果实精制物。

表2 粗提物经大孔吸附树脂精制得到的各流份的质量Tab.2 Quality of each fraction separated by macroporous resin from the crude extract

2.3 提取物中没食子酸的定量分析结果

将7 个浓度梯度的标准溶液进行HPLC 分析，以没食子酸的浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行回归分析，得到没食子酸的回归方程为y=10 006x+762.89（R2=0.999 1），表明没食子酸在0.05～1.60 mg/mL 范围内线性关系良好。

表3 粗提物经大孔吸附树脂精制后各流份的卷烟感官评价结果Tab.3 Result of sensory evaluation of each fraction separated by macroporous resin from the crude extract

将按1.2.5 节中方法配制的供试样品溶液进行HPLC 定量分析，3 种余甘子果实提取物中没食子酸的质量分数如表4 所示。结果表明：相比余甘子果实粗提物和除去多糖的余甘子果实粗提物，没食子酸在余甘子果实精制物中的质量分数分别提高了144.79%和38.05%。

2.4 精制前后余甘子果实提取物在卷烟中应用的感官评价比较

余甘子果实粗提物、除去多糖余甘子果实粗提物和余甘子果实精制物的卷烟感官评吸结果（表5）显示，与余甘子果实粗提物和除去多糖余甘子果实粗提物相比，余甘子果实精制物在修饰卷烟烟气和提高卷烟舒适性方面效果最佳：一是降低了粗提物产生的麻刺和粗糙感；二是可突出润甜感，改善舒适性；三是使烟气更加柔和、细腻。

表4 3 种余甘子果实提取物中没食子酸的质量分数及增量百分比Tab.4 Gallic acid contents and increasing percentages of three Phyllanthus emblica extracts

表5 3 种余甘子果实提取物的卷烟应用感官评价结果Tab.5 Sensory evaluation results from test cigarettes added with three different Phyllanthus emblica extracts

3 结论

①3 种不同溶剂的余甘子果实提取物中化学成分差异明显，感官评价和提取得率结果均为：纯水＞50%乙醇＞90%乙醇，确定了纯水为最优提取溶剂。②采用AB-8 型大孔吸附树脂方法，利用纯水洗脱，即可制备余甘子果实精制物；精制物中酚酸类成分得到有效富集，其中代表性成分没食子酸的质量分数显著提高。③相较于余甘子果实粗提物，余甘子果实精制物在修饰卷烟烟气、改善润甜感、降低刺激和提高卷烟舒适性方面效果突出。本研究结果可为应用大孔吸附树脂法开发天然植物香原料提供参考。