双抗烟草黑胫病和TMV 种质的创制

方敦煌，童治军，焦芳婵，吴兴富，张光海，肖炳光，张谊寒，李永平，陈学军

云南省烟草农业科学研究院 烟草行业烟草生物技术育种重点实验室国家烟草基因工程研究中心，昆明市五华区圆通街33 号 650021

黑胫病是我国烟叶生产中的主要土传病害之一，主要危害烟草根及茎基部，每年造成较大的经济损失。普通烟草花叶病（TMV）也是云南等烟叶主产区分布广、危害重的病害［1-2］。因此，选育推广抗黑胫病及TMV 的品种，是应对这两种病害的最为经济和有效的防控手段。有性杂交、系统选育、杂种优势利用是传统育种的3 种重要方法，目前我国主栽烤烟品种主要通过有性杂交育种、系统选育和杂种优势利用并重选育而成。但传统育种存在周期长、筛选效率低等问题，而且育成的新品种单一、遗传基础狭窄、品质与抗性不能兼顾。为创新种质资源、培育多抗品种、缩短育种周期，开发了单倍体育种技术，如利用单倍体通过2 个世代即可获得纯合双单倍体（DH）系。利用花药培养、远缘杂交及栽培种间杂交，因孤雌生殖获得单倍体是包括烟草在内的多种作物最常用的途径［3］，远缘杂交及栽培种间杂交获得的母本来源单倍体（MDH）除了能快速育成来自母本遗传性状的稳定纯系，还具有农艺性状及产质量稳定的优点。花药加倍培养获得的双单倍体（DH）存在农艺性状较差、产量低的缺陷［4］，栽培种之间杂交因孤雌生殖也可诱导MDH 单倍体，但频率极低，已被Lewis 等［5］转拟南芥花青素转录因子PAP1 基因的品种所证实。远缘杂交诱导单倍体技术是一种以普通烟草（Nicotiana tabacum）为母本、野生种非洲烟草（Nicotiana africana）为父本的杂交后代孤雌生殖所产生的单倍体［4］，因而在常规育种基础上，母本起源单倍体育种等新技术也在育种实践中得到广泛使用，其在缩短育种周期、提高目标性状筛选效率等方面发挥了重要作用。20 世纪90 年代以来美国先后培育出NC2000、NC71 和NC196 等烟草品种［6-9］。本项目组在前期适宜的授粉时期和套袋方式对单倍体诱导频率研究的基础上［10］，获得了双抗TMV 和PVY 的烟草株系［11］。为此，采用野生种非洲烟草并通过杂交技术，以烟草黑胫病（Phytophthora nicotianae）（0 号生理小种）抗源Coker 371［12］与普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus，TMV）抗源Coker176［13］为材料进行了双抗黑胫病及TMV 的种质资源创制，旨在为优良、特色品种的抗病性定向改良提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通烟草（N. tabacum）红花大金元（红大）、Coker371 和Coker176，烟属野生种非洲烟草（N.africana），均由云南省烟草农业科学研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 母本来源杂交

以Coker371 为母本、Coker176 为父本进行常规杂交，获得Coker371×Coker176 杂交F1种（简称CC）。再以CC 为母本、野生种非洲烟草为父本，参照曾建敏等［9］优化的方式授粉、纸管套袋，收获成熟的烟草杂交种子。

1.2.2 母本来源单倍体鉴别

按Wernsman 等［3］描述的方法进行单倍体苗期形态鉴别；用流式细胞仪测定其形态鉴别为单倍体植株的染色体倍型。

1.2.3 母本来源单倍体植株的分子标记辅助选择及组织培养加倍

分子标记辅助选择时，抗黑胫病的PhP基因分子标记检测、抗TMV 的N基因分子标记检测分别参照Lewis 等［13］和Johnson 等［12］的方法进行。

组织培养加倍按Kasperbauer 等［14］和刘勇等［11］改进的方法进行。选择的母本来源单倍体植株进入现蕾期（图1b）后，取中部叶片中脉，在超净工作台先用75 %乙醇消毒1 min，无菌水冲洗2 次，将切好的叶脉接种到MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的诱芽培养基上，培养20 d 后且叶片长出丛生芽2 cm 高时，切取芽接种到1/2MS 培养基+IBA 0.5 mg/L 中进行诱根生长培养。

1.2.4 双抗种质的鉴别

采用菌丝块创伤贴接法进行黑胫病抗性鉴定。每个株系处理24 株，重复3 次，以病情指数评 价 抗 感 性［15］；采 用 国 家 标 准GB/T 23222—2008［16］进行TMV 抗性鉴定，病毒汁液摩擦接种，3次重复，每重复16 株。按1.2.3 中母本来源单倍体植株的分子标记辅助选择方法进行分子标记辅助检测。

在云南省烟草农业科学研究院试验基地进行农艺性状试验。试验地块为红壤土，土壤肥力中等。采用随机区组设计，3 次重复，每小区面积40 m2，株行距0.50 m ×1.20 m，施纯氮90 kg/hm2［m（N）∶m（P）∶m（K）=1∶1.5∶2］。移栽32 d 后，每周分别测定红大、Coker371、Coker176 和筛选获得的双抗TMV 及黑胫病种质的株高与叶片数，连续测定6周；烟株打顶后调查株高、腰叶长宽、节距和茎围等农艺性状指标［17］。

1.2.5 数据处理

采用DPS 10.5 统计分析软件进行数据分析。Duncan’s 新复极差法进行数据间差异的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 母本来源单倍体的鉴别

母本来源获得的杂交种播种25 d 后，发现远缘杂交后代大部分苗出现致死性状，这与前人的研究结果一致［15］。存活的烟苗中，多数为混倍体，两片真叶表现凹痕的烟苗为单倍体苗（图1a），至现蕾期仍有部分叶片表现为凹痕（图1b）。流式细胞术倍性分析表明，母本来源的单倍体峰值位于24 500（图1 c），而对照红大的峰值位于49 800（图1 d）。

2.2 分子标记辅助筛选及组织培养加倍

对获得的5 株母本来源单倍体材料进行抗黑胫病PhP基因和抗TMVN基因分子标记分析，结果见图2。从图2 中可见，扩增出约770 bp 的PhP基因特异片断的单倍体植株为H1、H4 和H5，扩增出约540 bpN基因特异片断的植株为H1、H2、H3和H4，选择能同时扩增PhP基因片段和N基因片段的H1 和H4 作为双抗母本来源的单倍体植株。

目标单倍体植株现蕾后，H1 和H4 的总叶片数相同，均为13 片，而H1 的腰叶（长×宽为35 cm×25 cm）大于H4（37 cm×20 cm），故选择H1 单倍体植株进行组织培养加倍。取H1 植株中部叶片叶脉（图3a），消毒并切除叶脉边缘叶肉后接种到加倍培养基上（图3b），35 d 左右叶脉长出丛生芽（图3c），丛生芽生根移栽后，获得正常开花结实的加倍母本来源单倍体（图3d），命名为RBST［双抗黑胫病及TMV 烤烟新种质（Resistant to black shank and TMV）］，单株形态见图4。

2.3 双抗RBST 种质的鉴别

黑胫病苗期抗性鉴定结果（表1）表明，加倍母本来源单倍体RBST 和Coker371 的病情指数均为0，Coker176 和红大的病情指数分别为87 和92。TMV 抗病性鉴定结果（表1）表明，RBST 与Coker 176 表现出枯斑，而Coker371 和红大无枯斑反应，系统侵染表现为花叶。抗黑胫病的PhP基因分子标记检测和抗TMV 的N基因分子标记检测结果（图5）表明，RBST 材料可扩增出抗黑胫病的PhP基因和抗TMV 的N基因特异片段，与常规抗性鉴定结果相吻合。

表1 双单倍体的抗性鉴定Tab.1 Resistance identification of double haploid

农艺性状指标调查结果（图6）表明，供试材料均在移栽后39 d 生长速率明显加快。在移栽后53 d 3 份抗病材料烟株株高依然增长，而常规红大品种株高增长则趋缓；Coker176 品种叶片数增加趋缓，而其他材料叶片数仍在较快增加。

株高、叶长、叶宽、节距及茎围等农艺性状指标测定结果（图7）表明，RBST 材料除株高与其他材料无显著差异外，腰叶长与宽、节距及茎围均显著低于主栽品种红大，腰叶长显著低于双亲，但节距、茎围与双亲差异不显著。

3 讨论

在前期研究基础上［10-11］利用母本来源单倍体育种技术，采用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）进行苗期单倍体辅助筛选，并创制了双抗黑胫病和TMV 的种质RBST，可用于烟草品种的抗病改良和PhP基因的定位克隆［18］。母本来源单倍体育种技术也可快速聚合2 种及以上的其他性状，获得性状稳定的新品种。再次验证了母本来源单倍体育种技术在烟草育种中具有基因型多样化、周期短、选择效率高、易操作等优点，能快速稳定抗病等优良性状、提高育种筛选效率、加快烟草育种进程，只需两代即可获高纯度、不受遗传背景限制的双单倍体系。同时，在遗传学研究上可应用于遗传图谱的构建、基因定位及克隆。

在利用母本来源单倍体育种技术实践中，提高单倍体诱导率、筛选效率和加倍率是三大关键技术环节，决定着整个育种工作流程的效率和工效。Lewis 等［5］及Hancock 等［19］学者采用转基因手段，实现了苗期单倍体植株的高效筛选，但因存在转基因材料扩散的风险而难以推广使用。因此，在探究不同生态环境、不同母本基因型以及不同生态型与母本基因型互作对单倍体诱导率影响的基础上，采用非转基因手段，拓宽类似非洲烟草单倍体诱导系，研究适宜的与单倍体密切相关的标记，不断提高杂交诱导产生单倍体的诱导率方面还有待进一步深入试验。同时，杂交诱导孤雌生殖的机理及其遗传规律、加倍机制也是母本来源单倍体育种技术的重要课题，有待进一步研究。

4 结论

通过优化的纸管法增加单倍体诱导率、苗期形态和流式细胞术配合快速高效筛选单倍体、分子标记辅助选择和人工接种相结合进行抗病鉴定，利用母本来源单倍体育种技术将携带黑胫病抗性PhP基因的Coker 371 与TMV 抗性N基因的Coker 176 杂交F1与烟属野生种非洲烟草杂交，创制了双抗黑胫病及TMV 的种质RBST。苗期人工接种抗病鉴定、分子标记辅助检测和田间农艺性状鉴定表明，RBST 的抗病性和农艺性状稳定，可用作烟草品种抗性定向改良的抗源材料。