烟草烟碱相关miRNA 筛选及验证

许亚龙，陈千思，谢小东，刘萍萍，翟 妞，金静静，王 晨，曹培健

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

烟碱是烟草中含量最高的生物碱，约占总生物碱含量的90%左右［1］。生物碱与很多植物的抗虫性密切相关［2］。烟碱在烟草根组织中合成［3］，通过木质部运输到其他组织器官，主要在叶片中累积。烟碱是由四氢吡咯和吡啶环相连组成的，参与四氢吡咯环形成的有鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）［4］、精氨酸脱羧酶（Argine decarboxylase，ADC）［5］、N-甲 基 转 移 酶（N-methyltransferase，PMT）［6］和N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrescine oxidase，MPO）［7］。参与烟碱吡啶环形成的有天冬氨酸氧化酶（Aspartate oxidase，AO）、喹 啉 酸 合 成 酶（Quinolinic acid synthase，QS）［8］和喹啉酸核糖转移酶（Quinolinic acid phosphoribosyl trasferase，QPT）［9-11］。烟 草中A622基因和小檗碱连接酶家族-黄素-氧化酶（Flavin-containing oxidases of the berberine bridge enzyme family，BBLs）基因可能参与了最后的吡咯和吡啶环的缩合［12］。细胞色素氧化酶P450 家族的烟碱-N-去甲基化酶（NicotineN-demethylase，NND）可催化烟碱生成降烟碱［13-14］。MATE（Multi antimicrobial extrusion）和NUP（Nicotine uptake permease）蛋白在烟碱转运中起重要作用［15-16］。ERF（Ethylene responsive factor）和bHLH（Basic helix-loop-helix）两个转录因子家族的一些成员是烟碱合成通路上一些基因的重要顺式调控元件［17-20］。

miRNA 是一类在各物种中广泛存在的长度为21～24 个碱基的内源性小RNA［21］，对靶基因起负调控作用，可通过碱基互补配对在转录后水平介导靶基因的切割，或者通过降低靶基因的翻译来调节基因的表达。miRNA 在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用。例如：在拟南芥中，At-miR2923 与花粉发育有关［22］，At-miR164 可以调控拟南芥花瓣的数目［23］，At-miR160 可以通过与ARF10、ARF16 作用来调控根冠细胞的形成［24-25］；在水稻中，miR399 可以抑制磷饥饿应答关键调控基 因LTN1［26］。Li 等［27］发 现nta-miRX27 能 够 抑制烟碱合成途径中的NtQPT2；Guo 等［28］基于Small RNAseq 在烟草中发现了33 个保守的和51 个新miRNA，同时使用芯片技术分析了它们在根、茎、叶和花组织中的表达情况以及受打顶响应的miRNA。另外Guo 等［29-31］也分析了烟草中打顶和机械损伤响应的miRNA。

虽然人们对特定物种中miRNA 的种类和数量以及少量miRNA 的功能和作用机制有一定的了解，但对烟草中烟碱合成相关miRNA 的研究还不多。为此，利用生物信息学方法，对烟草小RNA 二代测序数据进行分析，挖掘出烟碱相关miRNA 及其靶基因，并利用分子生物学技术构建miRNA 过表达转基因材料，通过检测过表达材料的靶基因相对表达量和相对烟碱含量，旨在筛选烟碱相关的miRNA 并明确候选miRNA 对烟草中烟碱含量的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 烟草材料

miRNA 测序所用样品：本研究中选取烟草的品种为红花大金元，在山东省青岛市的试验基地采用常规的栽培措施进行种植。选择盛花期（大田移栽60 d 左右），打顶前和打顶后3 个发育时期，取长势一致的9 株烟，采集第15 片叶，每3 片叶为1 组，叶片去梗后用锡箔纸包好，快速放入液氮中。取完叶片的烟株，继续采集根系。打掉叶片，挖出根系，尽量减少须根损失，冲洗根，剪取须根，清洗至无明显土壤残留，用吸水纸尽量挤干水分，用锡箔纸包好后快速放入液氮中。

过表达材料：过表达miRNA2635 和miRNA203转基因幼苗转移至MS 培养基上，待幼苗长至4 片真叶时，移栽到小盆钵中，置于国家烟草基因研究中心温室生长，温室条件为28 ℃光照16 h，23 ℃黑暗8 h。分别收集旺长期根和叶的样品，经液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.1.2 试剂和仪器

TriZol 试剂购买自美国Invitrogen 公司；高保真DNA 聚合酶Prime STAR GXL DNA Polymerase、DNA 凝胶回收试剂盒、质粒DNA 小量纯化试剂盒、限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司；In-Fusion HD Cloning Plus 试剂盒购于美国Clontech 公司；cDNA 合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 购 自 瑞 士Roche 公 司。5424 型离心机（德国Eppendorf 公司）；2720 型PCR 仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；DYY-7C 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；1600 型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；1652100 型电转化仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；DK-98-Ⅱ型水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）；GX-45B 型培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；ZHWY-1102C 型摇床（上海智诚分析仪器制造有限公司）；Nanodrop 2000 分光光度计（美国Thermo Fisher 公司）；Agilent 2100 生物分析仪（美国Agilent 公司）；HiSeq 2500 测序仪（美国Illumina 公司）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取

采用TriZol 法提取烟草各组织RNA，实验操作严格按照产品说明书进行。在提取过程中，加入RNase-free DNase I 消化可能残留的基因组DNA。提取完成后，各RNA 样品的浓度和质量分别用Nanodrop 2000 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 小RNA 文库构建及测序

完成样品RNA 提取并通过质控后，使用PAGE 胶分离不同片段大小的RNA。切取18～30个碱基之间的条带，回收小RNA。按照华大基因标准的Illumina smRNA 建库方法构建测序文库。使用Agilent 2100 生物分析仪和PCR 仪对建好的文库进行质量和产量检测。检测合格后，按照Illumina 标准的测序流程和方法在HiSeq 2500 测序仪上进行测序。

1.2.3 烟草miRNA 的鉴定及靶标预测

使用fastq_to_fasta 将fq格式的软件转换为fasta格式，然后使process-reads-fasta.py 脚本对转换后的fa 文件进行转换预处理，使用bowtie-align-reads.py脚本将转换后的序列比对到烟草参考基因组，随后使用miR_PREFeR.py 预测流程脚本进行烟草miRNA 预 测［32］。使 用psRobot_tar 对 候 选 烟 草miRNA 进行靶基因预测［33］。

1.2.4 miRNA 二级结构预测

miRNA 前体可形成发卡状的二级结构，使用RNALfold 预测前体的二级结构并使用RNAplot 软件绘图［34］。

1.2.5 过表达载体构建

加入设计好的目标片段引物（表1），以红花大金元烟草基因组DNA 样品为模板进行PCR 扩增目标片段。PC2300S 载体用SacI与BamHI双酶切处理并回收，与PCR 扩增产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，涂抗性平板，挑选克隆子摇菌，用上游引物与PCB-seqE 菌落PCR 验证阳性克隆，然后进行测序验证。

表1 过表达载体构建引物Tab.1 Primers for over-expression vector

1.2.6 RT-PCR

以cDNA 反转录原液的30 倍稀释液为模板，以烟草U6（miRNA 定量）和26S（NtQPT2定量）基因为内参基因，扩增体系如下：10 μL 2×SYBR Green Mix，4 μL cDNA，2 μL Primer F（2 μM）、Primer R（2 μM）和ddH2O。反应程序为95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃50 s，40 个循环。扩增引物如表2 所示。

表2 定量PCR 引物Tab.2 Primers for qPCR

1.2.7 烟碱含量检测

新鲜烟叶冷冻干燥，称取0.15 g冻干鲜叶粉置于15 mL螺口耐压试管中，加入1.75 mL 质量分数5%的氢氧化钠溶液，湿润试样，静置15 min，加入10 mL 质量分数0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加盖密封后置于超声波发生器内室温下超声萃取15 min，然后在6 000 r/min条件下离心5 min。取2 mL 有机相进行GC/MS 分析，检测烟碱含量；准确移取5 mL有机相浓缩到0.5 mL，进行GC/MS 分析，检测其他低含量生物碱。烟碱与其他低含量生物碱的检测分两次进样完成，采用保留时间和选择离子监测（SIM）模式定性，双内标定量［35］。

2 结果与分析

2.1 烟草miRNA 的鉴定及分析

39 个测序样品冗余数据量平均为17.72 MB，非冗余数据量平均为5.55 MB（图1）。经过分析，从39个样品中共预测了2 925个非冗余的miRNA成熟体和3 082个前体。通过和miRbase［36］中已知的植物miRNA（包含164 个已知的烟草miRNA）成熟体比对，其中有1 245 个miRNA 能够比对上，这些miRNA 被认定为具有高可信度的miRNA，其中有43 个是烟草中已知的miRNA。对预测成熟miRNA 序列长度和碱基组成进行分析，发现miRNA 的长度主要集中在21～22 个碱基之间，在碱基偏好性方面，首碱基更偏向为A 和U（图2）。

2.2 烟碱相关miRNA 筛选

以红花大金元71 456 条cDNA 序列为靶基因库，对烟草miRNA 进行靶标预测，2 925 个miRNA中的1 607 个miRNA 共预测出了5 309 个靶基因，平均每个miRNA 能够调控3.3 个靶基因。根据已有的烟碱通路相关的基因信息，获得了多个与烟碱相关的miRNA。表3 列出了部分筛选到的烟碱相关miRNA，其可能的靶基因位点如表4 所示。对miRNA 前体二级结构的分析发现表3 中的miRNA 前体均能形成稳定的发卡结构（图3）。

2.3 烟碱相关miRNA 对靶基因的调控

为确定候选的烟碱相关miRNA 是否调控了烟碱相关基因的表达，本研究中构建了miRNA203 和miR2635 的过表达转基因株系，对随机挑选的过表达株系进行qPCR 检测，发现OE-miRNA203-4/5、OE-miR2635-3/5 株系的miRNA表达量有较大提升。随后对筛选到的高表达株系（OE-miRNA203-4/5 和OE-miR2635-3/5）进行靶基因表达量qPCR 检测，结果显示靶基因表达量都有不同程度降低，在miRNA203 高表达株系中靶基因NtMATE1下降了近98%，在miRNA2635 高表达株系中靶基因NtQPT2下降了约48%～67%，miRNA 的表达量和靶基因的表达量明显负相关（图4）。

2.4 烟碱相关miRNA 对烟碱含量的影响

QPT基因在烟草烟碱的合成途径中有重要作用［11］，而NtMATE1在烟碱合成后的转运过程中有重要作用［15］。为了研究miRNA 过表达植株的烟碱含量是否受到了影响，对筛选到的miRNA 高表达株系进行了烟碱含量检测，发现miRNA 高表达株系中的烟碱、降烟碱含量均有不同程度下降。如图5 所示，在过表达miRNA203 和miRNA2635株系中，平均烟碱含量下降了约62%和69%，同时平均降烟碱含量分别下降了约69%和70%。故可得出结论，miRNA203 和miRNA2635 可通过降低相应靶基因表达量进而降低烟草中烟碱的含量。

表3 烟碱相关miRNA 及其潜在靶基因Tab.3 Nicotine related miRNAs and their potential target genes

3 讨论

本研究中从全基因组范围鉴定了2 925 个潜在的烟草miRNA，将预测出miRNA 的数量和miRbase 对比分析，本研究中预测的总数相对较多，不排除部分假阳性结果的存在，同时通过和其他植物的miRNA 比对，发现1 245 个miRNA 有同源序列，说明本研究中鉴定出了一些新的烟草miRNA。

通过对miRNA 靶基因预测，发现了多个可能调控烟碱的miRNA 基因。对预测的miRNA 序列进行分析，发现大部分成熟miRNA 的表达量较低，同时有很多miRNA*（来自前体的相对臂且表达丰度相对较低的miRNA）存在，说明可能有很多miRNA 的前体能够加工出两个成熟miRNA，miRNA 和对应的miRNA*虽然来自同一个前体，但在序列上仍有不同程度的差异，此特性可以加强miRNA 基因对靶基因的调控广度。

普通烟草是异源4 倍体，通过对预测的miRNA 序列和位置进行分析，发现有15 个miRNA存在多个拷贝现象，其中有2 个miRNA 的拷贝数分别为10 个和4 个，其余均为2 个拷贝。分析中还发现存在不同的miRNA 前体加工成相同的miRNA 成熟体的现象，通过此机制，可以增加特定miRNA 的表达量。此外，通过靶基因预测软件分析，发现烟草也存在1 个miRNA 同时靶向多个基因的现象，例如miR2635 除了能靶向NtQPT2，还能靶向1 个糖苷水解酶的基因。miRNA203 除了靶向NtMATE1外还能靶向1 个未知功能的基因，但互作区域序列相似性相对较低。

Li 等［27］发 现 的nta-miRX27 和 本 研 究 中 的miRNA2635 都能够抑制烟碱合成途径中的NtQPT2基因，经过序列比对，它们是两个不同的miRNA。为了验证候选miRNA 和烟碱相关靶基因的关系，本研究中建立了miRNA203 和miR2635的过表达遗传材料，虽然前面提到miRNA203 和miR2635 也有多个靶基因的情况，但从过表达植株的外在表型上看并未发现明显的异常性状，推测这可能与miRNA 与不同靶基因的作用强度以及时空表达有关。

此外，打顶是烟草种植过程中一项重要的农艺措施，能够去除烟草的顶端优势，直接或间接地改变激素的平衡、根的发育以及烟碱的合成等生物过程。很多学者对打顶响应的miRNA 进行了研究，例如Guo 等［28］发现了4 个打顶响应的miRNA；Qi 等［30］发现了15 个打顶响应差异表达的miRNA，并发现nta-miR164a、nta-miR159 和nta-miR167d*能够分别靶向与烟碱合成调控相关的转录因子NAC、MYB 和WRKY；Tang 等［31］在根组织中也发现了15 个打顶响应的miRNA。虽然上述研究中发现了多个打顶响应的miRNA，同时打顶能够直接或间接地引起多种代谢途径的反应，但是这些miRNA 最终能否直接靶向烟碱合成通路中的基因进而影响烟碱含量仍有待进一步研究。

4 结论

对3 个发育时期5 个不同组织的39 个红大品种烟草样品进行小RNA 高通量测序和生物信息学分析，从全基因组水平鉴定了2 925 个潜在的miRNA 基 因，其 中 有1 245 个miRNA 是 植 物 中 已发现的，包括43 个烟草中已知的miRNA。通过对miRNA 靶基因分析，发现了多个烟碱相关的miRNA。 过 表 达 实 验 结 果 表 明，miR2635 和miRNA203 能够通过分别调控靶基因NtQPT2和NtMATE1的表达进而调控烟草中的烟碱含量，烟碱含量平均下降约69%和62%。这些发现增进了对烟草miRNA 的了解，为烟碱的生物合成调控提供了新的调控元件。