烟草甲对不同波长光源的趋性及视蛋白序列分析

2021-03-18纪桂霞徐蓬军王秀芳谭菲菲王新伟任广伟

烟草科技 2021年2期

臧云，纪桂霞，杨鹏，徐蓬军，王秀芳，邓宁，谭菲菲，王新伟，任广伟*

1. 中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266101

2 .四川省烟草公司攀枝花市公司，四川省攀枝花市东区龙珠路31 号 617026

烟草甲［Lasioderma serricorne（Fabricius）］是一种世界性的仓储害虫，属鞘翅目（Coleoptera）、窃蠢科（Anobiidae）［1-2］。烟草甲食性复杂，既能取食一些仓储粮食和中草药，又能取食仓库中储藏的烟叶以及卷烟和雪茄等烟草制品。被蛀食后的烟叶因残缺不全、虫粪虫尸污染等严重影响烟叶的可用性。据统计，全世界每年因烟草甲等仓储害虫为害造成的烟叶虫蛀损失占烟叶总储存量的1%［3］；我国烟叶每年因仓储害虫为害造成的烟叶虫蛀损失大约为1.64%［4］。目前国内主要采取磷化氢熏蒸防治烟草甲，但磷化氢熏蒸若操作不当，会对作业人员、货物和环境造成安全隐患［5］，我国已于2020 年限制其使用［6］。因此，急需研究与环境相容性好，且使用安全的烟草甲防治措施，以减少熏蒸次数，有效控制仓储害虫。近年来，利用昆虫的趋光性进行诱杀已逐渐成为防治害虫的重要方式之一。与其他防治方法相比，灯光诱捕防治有利于延缓害虫抗药性、降低防治成本、减少环境污染，符合生态治理的发展方向［7-8］。已有研究证实，烟草甲具有一定的趋光性，Kirkpatrick 等［9］、Soderstrom 等［10］试验发现多数烟草甲成虫会被紫光吸引；Tsuji［11］研究表明两个紫光灯管的诱虫灯对烟草甲的诱捕数量显著高于1 个紫光灯管的诱虫灯；Katsuki 等［12］试验比较了7 种LED 灯对烟草甲的诱集率，其中紫光和蓝光LED 灯比其他光源LED 灯吸引的烟草甲更多；Hironaka 等［13］发现在光强相同时，紫光LED 灯比蓝光LED 灯更能吸引烟草甲。可见，以往的研究多关注不同颜色灯光对烟草甲的吸引作用，但对光波长的系统研究报道较少。

昆虫对光的感知依赖于由视蛋白和发色团组成的视紫红质［14］，其中视蛋白是一种具有7 个跨膜结构域和一个赖氨酸残基的G 蛋白偶联受体［15］，其氨基酸序列的不同影响昆虫对敏感光的吸收［16］。由于基因复制和缺失导致的适应性进化不同，昆虫视蛋白从类型到拷贝数均有所不同［17］。多数昆虫具有3 种视蛋白，包括紫外敏感视蛋白（UV）、蓝光敏感视蛋白（BL）和长波敏感视蛋白（LW），分别形成对紫色光（325 ～430 nm）、蓝色光（430 ～500 nm）和绿色光（＞500 nm）波长最敏感的光色素［18-19］。在鞘翅目昆虫中有一些缺失BL 视蛋白［20-21］，红蜻蜓（Sympetrum frequens）拥有多个视蛋白基因［22］，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）则进化出1 个新的亚家族，命名为蓝绿敏感蛋白［18-19］，但烟草甲视蛋白基因序列和相关特征目前尚不明确。为此，在前人研究基础上，以7 种波长LED 灯为测试对象进行了烟草甲趋光性试验，并克隆获得了烟草甲视蛋白基因，旨在为将灯光诱捕技术应用于烟草仓储害虫的综合治理提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试虫源烟草甲采自中国农业科学院烟草研究所烟叶样品储藏室，用全麦酵母粉饲料在人工培养箱内继代大量繁殖后，取生长发育时期一致的成虫备用。饲养条件为：温度（28±1）℃、相对湿度75%±5%。

趋光行为测试装置由行为反应箱和光源箱组成，参考Reisenman等［23］的方法并进行改进，见图1。行为反应箱长600 mm、宽310 mm，分为光区和暗区两部分，光区高500 mm、暗区高200 mm；顶部安装光源，光源箱与光区均密闭不透光。试验时在光区放入白色粘虫板。

供试光源为不同波长LED 灯，由河南新乡市天意新能源科技开发有限公司提供，波长分别为360 ～365、400 ～405、450 ～460、515 ～525、600 ～605、620 ～625 和640 ～665 nm，使用Hioki 3423 照度计在50 cm 处测得上述波长LED 灯光照度分别为5.2、4.6、49.4、242.0、25.4、55.0 和26.8 Lx，供试LED 灯电压均为12 V。

实仓诱捕试验所用风吸式杀虫灯由浙江安吉安宁生物科技有限公司提供。根据上述波长筛选后选用包含最佳诱虫波长的常用市售杀虫灯（AN-D-1008）进行实仓诱虫试验，灯光峰值波长400 nm 左右，距离灯管0.5、1.0 和1.5 m 处光照度分别为21.5、19.8 和17.7 Lx；设置黑光灯管作为对照，峰值波长380 nm，0.5、1.0 和1.5 m 处光照度分别为32.0、28.5 和26.9 Lx。

1.2 试验方法

1.2.1 不同波长灯光诱集试验

2019 年7 ～8 月在中国农业科学院烟草研究所实验室内进行不同波长灯光诱集试验。实验室温度（26 ± 2）℃，相对湿度70%～80%。挑选2 日龄烟草甲成虫进行测试，烟草甲成虫预先置于黑暗环境中处理1 h，再放入行为反应箱的暗区，待处理15、30 和60 min 后，分别记录在暗区的试虫数，并计算趋光率。每波长灯光分别处理20 头，重复5 次。

1.2.2 实仓诱捕试验

2019 年8～9 月在中国农业科学院烟草研究所烟叶仓库内进行诱虫试验。仓库温度（26 ±2）℃，相对湿度70% ～80%，仓库面积40 m2，仓库内存放2016 ～2018 年云南、福建、山东等烟区生产的C3F、B2F 和X2F 等级初烤烟叶约500 kg，仓库内有大量烟草甲成虫。悬挂380 nm 和400 nm两种波长的杀虫灯各1 台，放置高度为1.5 m，两灯相距5 m，试验中期两台杀虫灯互换位置，以消除杀虫灯位置差异产生的影响。每天18∶00 开灯，次日8∶00 关灯，每天8∶30 调查各处理诱集的烟草甲成虫数量，连续调查16 d。

1.2.3 烟草甲转录组测序

采集烟草甲幼虫、蛹和雌雄成虫各50 头，混合后利用Tirzol 法提取RNA，具体步骤按照日本TaKaRa 公司动物组织RNA 提取方法说明书进行。由上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序，并对数据进行汇编和注释。

1.2.4 基因克隆

根据转录组测序序列信息，获得烟草甲视蛋白基因序列。用日本TaKaRa Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒进行cDNA 反转录。利用Primer5.0 软件设计特异性引物，扩增LW基因的上游引物为LSlw-F：5′-TGACCACCA CCATATCCG-3′，扩增LW基因的下游引物为LSlw-R：5′-ATTTTCCGTGTCCGTTTT-3′，扩增UV 基因的上游引物为LSuv-F：5′-ATGAACCTATACCTGAACT G-3′，扩增UV基因的下游引物为LSuv-R：5′- TTAAG AAGCAGCAGCAG-3′，引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成。使用日本TaKaRa 公司的TaqTM进行PCR 扩增，PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 完成后，使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit 试剂盒进行胶回收。胶回收产物连接到T3 载体上，室温连接30 min，连接产物转至Trans1-T1 感受态细胞，加入无添加抗生素的LB 液体培养基于37 ℃、2 000 r/min 条件下振荡培养，取菌液涂布在LB 固体培养基上，在37 ℃培养箱中过夜培养。待菌落长出后随机挑选单菌落，用通用引物M13F 和M13R 进行菌液PCR 检测，选取阳性克隆菌株由上海派森诺生物科技股份有限公司测序。

1.2.5 序列生物信息学分析

将序列在NCBI 中用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具进行同源性分析，利用在线软件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.Html）查找序列的开放阅读框，运用DNAMAN 软件预测其编码的氨基酸序列、蛋白分子量、等电点等理化指标，运用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件分析跨膜结构。采用Mega 10 软件用NJ 法构建系统进化树。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 17.0 数据分析软件进行单因素方差分析和独立样本t检验，通过Turkey 法检验各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同波长灯光对烟草甲的诱集效果

不同波长灯光对烟草甲的诱集效果见图2。烟草甲对不同波长光源的趋性存在一定差异。烟草甲对400～405 nm 波长的趋性显著高于对其他波长的趋性，趋光率达74%；对600～605 nm 波长的趋性显著高于对450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波长的趋性，趋光率为50%左右；而对450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波长的趋性最差，趋光率分别为35%、37%和35%，且三者间差异不显著。

2.2 诱虫灯对烟草甲的实仓诱捕效果

根据2.1 节的试验结果，选取对烟草甲诱集作用效果最强的400 nm 波长诱虫灯进行实仓诱捕试验，以380 nm 波长的诱虫灯为对照，观察该波长在烟叶仓库中诱杀烟草甲的效果。结果表明，400 nm 诱虫灯对烟草甲的平均每日诱集量显著高于380 nm 的诱虫灯（图3），其中400 nm 诱虫灯平均每日诱虫数量为632 头，380 nm 的诱虫灯平均每日诱虫数量仅为286 头。与室内趋光性试验结果一致。实仓诱捕试验结果进一步说明400 nm 波长的光源可高效诱集烟草甲。

2.3 烟草甲转录组的测序分析

烟草甲的转录组测序结果见表1。在烟草甲中共获得总计6.49 Gb 的数据。组装并去冗余后得到26 761 条Unigene，总长度、平均长度、N50 以及GC 含量分别为36 659 980 bp、1 369 bp、2 376 bp 和43.57%。将Unigene 比对到功能数据库进行注释，最终分别有18 947（NR：70.80%）、6 007（NT：22.45%）、15 000（SwissProt：56.05%）、14 467（KOG：54.06%）、15 336（KEGG：57.31%）、10 256（GO：38.32%）以及15 688（InterPro：58.62%）个Unigene 获得功能注释。使用Transdecoder 检测出21 222 个CDS。同时还检测出2 561 个SSR 分布于1 994 个Unigene 中，同时预测出2 915 个编码转录因子的Unigene。表明测序质量较好，数据具有可靠性。

表1 烟草甲转录组的测序结果Tab.1 Sequencing results of transcriptome data for Lasioderma serricorne

2.4 烟草甲UV 和LW 视蛋白基因的克隆

通过功能注释得到两个视蛋白基因作为参考序列进行基因克隆（图4），最终获得了烟草甲UV视蛋白序列（登录号为MT040761）和LW 视蛋白序列（登录号为MT040760）。序列分析结果（图5）显示，烟草甲UV 视蛋白基因开放阅读框为1 182 bp，编码392 个氨基酸，预测分子量为43.78 kD，理论等电点为7.95；烟草甲LW 视蛋白基因开放阅读框为1 134 bp，编码376 个氨基酸，预测分子量为41.58 kD，理论等电点为8.43。表明烟草甲UV 和LW 视蛋白皆属于具有7 个跨膜结构域的G 蛋白偶联受体超家族。

2.5 烟草甲UV 和LW 视蛋白的系统进化分析

蛋白质序列比对结果（图6）表明，烟草甲视蛋白序列和其他3 种昆虫的视蛋白序列一致性均较高。用烟草甲和其他19 种昆虫的42 个视蛋白的氨基酸序列构建NJ 树。系统发育树分析结果（图7）表明，烟草甲UV 视蛋白与鞘翅目昆虫UV 视蛋白汇聚在一起，烟草甲UV 视蛋白的氨基酸序列与一种鞘翅目豉甲科昆虫Gyrinus marinus的序列一致性最高，同源性约为74%；烟草甲LW 视蛋白与鞘翅目昆虫LW 视蛋白汇聚在一起，LW 视蛋白的氨基酸序列与基刺瘤木长蠹（Xylobiops basilaris）的序列一致性最高，同源性约为86%。烟草甲缺失BL 视蛋白，从图7 可看出，其他几种鞘翅目昆虫中也同样缺失BL 视蛋白。鞘翅目G.marinus、鳞翅目棉铃虫（Helicoverpa armigera）、半翅目烟盲蝽（Nesidiocoris tenuis）、膜翅目蜜蜂（Apis mellifera）和丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）皆有两个UV视蛋白，鳞翅目海神袖蝶（Heliconius doris）、宽红袖蝶（Heliconius hortense）以及双翅目黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）分别有两个LW 视蛋白。

3 讨论

利用昆虫的趋光性是害虫防控的有效依据，且具有环境友好的优点。近年来，多位学者对昆虫的趋光行为研究发现，包括光源波长、昆虫性别、强度等对昆虫趋光行为均有影响［24］。如谷蠹Rhizopertha dominica对530 nm 绿光和570 nm 黄光趋性最强，并且光强度越大，趋光行为越强［25］；绿盲蝽Apolygus lucorum雌成虫在562 nm 绿光区有趋光高峰，但雄成虫没有［26］。光源波长作为影响昆虫趋光行为的最主要因素，不同昆虫种类因其生物学、生态学特性不同，对不同波长光的选择也存在差异，多数昆虫的敏感波长在280 ～400 nm的紫外范围和400 ～700 nm 的可见光范围内［27-28］。本研究中利用7 种波长LED 灯诱集烟草甲，发现烟草甲对400 ～405 nm 波长（紫光）的趋性最强，对600 ～605 nm 波长（橙光）的趋性次之。与Katsuki等［12］试验发现的紫光和蓝光效果最好的研究结果稍有不同，本试验中450 ～460 nm（蓝光）诱集效果一般，可能与Katsuki 等使用蓝光LED 的光强不同有关。本研究中实仓诱捕试验结果进一步表明，400 nm 波长的光源可高效诱集烟草甲，综合前人研究结果来看，烟草甲对紫光趋性最强，与本试验结果基本一致［9-13］。

昆虫趋光行为复杂，视蛋白是接受光刺激的关键分子，影响多种昆虫的光诱导行为，深入分析烟草甲视蛋白对揭示其趋光机理具有重要意义。尽管多数昆虫存在UV、BL 和LW 3 种视蛋白，但在一些鞘翅目昆虫中缺失BL 视蛋白，烟草甲同样缺失BL 视蛋白，且烟草甲对450 ～460 nm（蓝光）的趋性较差。已有的研究发现，鞘翅目昆虫可通过UV 和LW 视蛋白基因复制中各位点的改变，重建其对于蓝光波长的敏感性［29］，且在赤拟谷盗中得到了证实［30］。而一些学者对昆虫视蛋白的表达研究发现，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）敲除LW 视蛋白后绿光对其吸引力降低［31］；柑橘木虱（Diaphorina citri）的UV、BW 和LW 视蛋白在白天具有较高的表达水平，降低视蛋白的表达水平则抑制其趋光行为［32］。说明视蛋白的表达水平与昆虫趋光行为呈正相关［14］。本研究中烟草甲对400～405 nm 和600 ～605 nm 波长的趋光行为，与UV视蛋白和LW 视蛋白对波长敏感范围一致，烟草甲的趋光行为可能与UV 视蛋白的高表达水平有关，但烟草甲在应对不同波长光源时的视蛋白表达量变化还有待进一步深入研究。