结直肠癌细胞凋亡与其微环境中免疫细胞凋亡和浸润程度的关系

余咸静

(四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院，四川 成都 410041)

结直肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，随着人们饮食结构中动物高蛋白比重的增加，我国结直肠癌发病率呈逐年增长趋势[1]。结直肠癌的发生可能与结肠癌细胞凋亡及组织微环境中免疫状态有关，肿瘤微环境是一个由免疫细胞、成纤维细胞、基质细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等多种基质细胞构成的综合系统，肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关，相对于外周血中免疫状态，肿瘤微环境免疫状态更能准确表达机体抗肿瘤免疫反应[2-3]。所以本研究旨在检测结直肠癌组织中癌细胞凋亡情况，T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、树突状细胞(DC细胞)等免疫细胞凋亡及浸润程度，分析结直肠癌细胞凋亡与免疫细胞凋亡及浸润程度的关系，了解微环境免疫细胞对结直肠癌恶化的重要性，为结直肠癌治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年4月至2019年4月期间本院收集的结直肠癌组织标本92例，包括结直肠癌组织、癌旁组织(避开坏死区，距离癌结节边缘2cm以上的结直肠组织)。男53例，女39例；年龄45～75岁，平均(58.17±6.48)岁；右半结肠癌27例，左半结肠癌35例，直肠癌30例。纳入标准：①结直肠癌组织、癌旁组织标本来源于经手术治疗的患者，经病理检查证实为结直肠癌；②结直肠癌患者术前均未进行放化疗；③组织标本的获取和使用均获得本院伦理委员会批准同意。排除合并其他恶性肿瘤者。

1.2 主要试剂

鼠抗人CD3单抗、鼠抗人CD56单抗、鼠抗人CD21单抗均购自北京中山生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自上海恒斐生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购自德国罗氏公司。

1.3 检测方法

1.3.1 结直肠癌微环境免疫细胞浸润程度的检测

采用免疫组化SP法对T细胞、NK细胞、DC细胞进行染色。石蜡切片厚度约为4μm，37℃烤箱放置过夜，经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3%过氧化氢灭活、抗原修复后，加入鼠抗人CD3单抗(标记T细胞)、鼠抗人CD56单抗(标记NK细胞)或鼠抗人CD21单抗(标记DC细胞)4℃孵育12h，PBS洗涤3次后，加入生物素化标记的二抗孵育1h。PBS清洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素孵育0.5h，最后采用DAB显色，细胞核采用苏木精复染，脱水后封片。

T细胞计数标准：细胞膜和细胞质被染为棕黄色者视作阳性细胞，先在100倍镜下寻找到癌细胞密集区，然后在200倍镜下选取25个视野，统计T细胞总数以表示结直肠癌微环境中T细胞浸润程度。

NK细胞、DC细胞计数标准：细胞膜和细胞质被染成棕黄色者视作阳性细胞，先在100倍镜下寻找到癌细胞密集区，然后在200倍镜下选取50个视野，统计细胞总数以表示结直肠癌微环境中NK细胞、DC细胞浸润程度。

1.3.2 细胞凋亡情况的检测

采用凋亡原位检测试剂盒检测凋亡细胞。石蜡切片厚度约为4μm，37℃烤箱放置过夜，经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，加入蛋白酶K工作液反应20min，0.3%过氧化氢灭活10min。然后加入TUNEL反应液，在湿盒内4℃孵育60min，再加入抗荧光素抗体，室温下孵育30min。最后采用DAB显色，细胞核采用苏木精复染，脱水后封片。

凋亡细胞判断标准：细胞核被染为棕黄色者视作阳性细胞。在100倍镜下寻找到癌细胞密集区，在400倍镜下选取10个视野，观察结肠癌细胞凋亡情况。在100倍镜下寻找到间质内免疫细胞聚集区，400倍镜下选取10个视野，观察免疫细胞凋亡情况。细胞凋亡水平以凋亡指数(apoptotic index，AI)评价，AI为100个细胞中阳性细胞比例[4]。由于TUNEL染色后，T细胞、NK细胞、DC细胞等免疫细胞无法区分，所以将T细胞、NK细胞、DC细胞作为整体计算肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的AI。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Pearson分析。检验水准α= 0.05，均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌及癌旁组织微环境免疫细胞浸润程度比较

结直肠癌组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度均低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1～3(封三)。

表1 结直肠癌及癌旁组织微环境免疫细胞浸润程度个)

2.2 结直肠癌及癌旁组织微环境细胞凋亡情况比较

结直肠癌组织TIL细胞AI高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 结直肠癌及癌旁组织微环境细胞凋亡情况指数

2.3 结直肠癌微环境中癌细胞凋亡与TIL细胞凋亡关系分析

通过表2，采用Pearson分析，得出结直肠癌细胞AI与TIL细胞AI呈负相关(r=-0.559，P<0.05)，见图4。

图4 结直肠癌细胞凋亡与TIL细胞凋亡的关系

2.4 结直肠癌微环境中癌细胞凋亡与免疫细胞浸润程度关系分析

通过表1，采用Pearson分析，得出结直肠癌细胞AI与T细胞浸润程度呈正相关(r=0.579，P<0.05)，结直肠癌细胞AI与NK细胞浸润程度呈正相关(r=0.614，P<0.05)，结直肠癌细胞AI与DC细胞浸润程度呈正相关(r=0.625，P<0.05),见图5～7。

图5 结直肠癌细胞凋亡与T细胞浸润的关系

图6 结直肠癌细胞凋亡与NK细胞浸润的关系

图7 结直肠癌细胞凋亡与DC细胞浸润的关系

3 讨 论

恶性肿瘤的发展与肿瘤远处转移、肿瘤细胞逃逸免疫监控、机体免疫功能较低等关系密切。机体免疫功能低下时，癌细胞相对活跃，可促进机体肿瘤形成，而肿瘤生长发育过程中也会反过来影响机体免疫功能，抑制免疫细胞杀伤功能，所以机体免疫功能与肿瘤细胞之间存在相互制约、互为因果的关系[5-7]。机体免疫方式包括细胞免疫和体液免疫，肿瘤形成后，细胞免疫是主要发挥抗肿瘤作用的免疫方式，体液免疫仅起到辅助作用[8]。

T细胞、NK细胞及DC细胞均参与机体细胞免疫反应。T细胞包括CD4分子和CD8分子，CD4分子结合MHCⅡ类分子后形成致敏Th1细胞，能诱发炎症反应，CD8分子结合MHCⅠ类分子后形成细胞毒性T淋巴细胞，不仅可分泌干扰素、肿瘤坏死因子，还可与肿瘤表面抗原结合形成抗原抗体复合物，对肿瘤细胞造成特异性杀伤[9]。NK细胞属于天然免疫细胞，是机体抗肿瘤的首要屏障，可在未刺激状态下杀伤肿瘤细胞。NK细胞数量与机体免疫功能、抗肿瘤作用有关，许多肿瘤患者体内均发现NK细胞数量减少、活化受体表达量降低等现象[10]。DC细胞为功能最强的抗原呈递细胞，其主要作用是将肿瘤细胞表面抗原及其代谢产物提呈给细胞毒性T淋巴细胞，起到杀伤肿瘤细胞作用[11]。

既往关于恶性肿瘤患者免疫功能的研究主要集中在外周血免疫细胞的变化分析，赵美淇等[12]采用流式细胞仪检测中的T淋巴细胞及NK细胞的表达水平，对肿瘤早期发现和早诊断有指导意义。近些年来，人们将关注点逐渐转移到肿瘤微环境免疫细胞与肿瘤发展的关系上。而本研究采用免疫组化、TUNEL实验检测结直肠癌及癌旁组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度及TIL细胞凋亡情况，结果显示，结直肠癌组织T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度显著低于癌旁组织，TIL细胞AI明显高于癌旁组织(P均<0.05)，提示结直肠癌细胞可能对微环境免疫细胞具有抑制作用。为了进一步明确结直肠癌细胞与微环境免疫细胞的关系，本研究经相关性分析结果显示，结直肠癌细胞AI与T细胞、NK细胞及DC细胞浸润程度均呈明显正相关，与TIL细胞AI呈明显负相关，提示结直肠癌细胞与微环境免疫细胞相互影响。Karki等[13]研究认为结直肠癌细胞凋亡减弱是结直肠癌发展的机制之一，并且有许多研究发现可通过促进结直肠癌细胞凋亡，抑制结直肠肿瘤发展[14-16]。由于细胞本身及环境因素均会对结直肠癌细胞凋亡产生影响，如T细胞、NK细胞可通过穿孔或Fas途径诱导结直肠癌细胞凋亡。同时，结肠癌细胞也可通过多种机制逃避机体免疫监控，引起免疫数量减少，DC细胞提呈肿瘤抗原能力减弱，初始T细胞活化受到抑制。Shimoyama等[17]研究发现，与结直肠腺瘤相比，结直肠癌Fas配体阳性表达率明显升高，认为Fas配体异常表达与结直肠癌发展有关。而有研究[18]在肝癌等其他恶性肿瘤中发现，与健康对照组相比，肝癌组患者基于Fas/Fasl途径的T淋巴细胞凋亡率明显增加，认为肝癌细胞出现免疫逃逸与其上调Fas配体表达引起T淋巴细胞凋亡有关。T细胞、NK细胞、DC细胞在激活后均表达Fas受体，所以推测结肠癌细胞可能会通过上调Fas配体，经Fas/Fasl途径诱导上述免疫细胞凋亡。

总而言之，结直肠癌微环境中免疫细胞状态能直接反映机体抗肿瘤免疫反应，微环境免疫细胞浸润程度、凋亡水平与结肠癌细胞凋亡水平有关，消除结直肠癌微环境中对免疫细胞的不利因素，可能会抑制结肠癌进一步恶化，这也为临床开发免疫治疗方法提供指导作用。