乳腺肿瘤患者血清miRNA-222、miRNA-21检测的临床意义

(1. 皖南医学院第一附属医院检验科，安徽 芜湖 241002；2. 安徽省芜湖市第一人民医院检验科，安徽 芜湖 241002)

在女性恶性肿瘤中，乳腺癌的发病率和病死率分别居第1、2位[1]。近年来我国女性乳腺癌发病率呈现出不断上升的趋势，乳腺癌易发生淋巴结转移，远处转移会严重降低乳腺癌患者的生活质量，是乳腺癌患者病死的主要原因[2-4]。乳腺癌如在原位阶段就被发现并予以切除，则预后较佳，可完全治愈，而转移性乳腺癌通常治疗效果不佳，预后差[5]。因此，对乳腺癌应该早发现、早诊断、早治疗。目前，在临床上乳腺钼靶摄影成像对乳腺癌的早期发现、早期诊断仍具有重要价值[6]。乳腺钼靶摄影成像等影像学检查方法虽应用广泛，但其需要依靠特定的直接或间接征象方能对乳腺癌作出诊断。

微小RNA(miRNA)，一种长度大约为19-25nt非编码RNA，可调控转录后的基因的表达。研究发现，miRNA在肿瘤的发生和发展中，可起着抑癌基因或癌基因的作用[7-8]。近来越来越多的研究[9-11]也发现异常的miRNA表达可以启动肿瘤的细胞增殖、侵袭、迁移、转移扩散等发生发展过程。因此，miRNA被认为是一种有前途的生物标志物，用于癌症发生发展的各个阶段的监测。

miRNA可稳定存在于血清、血浆中，能够抵抗核糖核酸酶和pH值波动并且有较长的储存期和多个冷冻、解冻周期[12]。本研究主要通过检测乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者以及健康体检者血清miRNA-222、miRNA-21水平，探讨其在乳腺肿瘤尤其是乳腺癌诊疗中的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月—2019年12月就诊于皖南医学院第一附属医院的35例首诊乳腺癌患者(按照国际抗癌协会分类标准：Ⅰ级2例，Ⅱ级30例，Ⅲ级3例；Ⅰ期5例，Ⅱ期28例，Ⅲ期2例；N022例，N113例)和32例乳腺良性肿瘤患者(纤维腺瘤20例，乳头状瘤8例，良性叶状瘤4例)。所有患者在采集标本前均未受到放疗、化疗等干预。同时，选取了本院体检中心的35名健康体检者作为对照组。所有受试者均为女性，年龄35～70岁，平均(54.00±2.20)岁。各位受试者均提供了书面同意，且研究方案已获皖南医学院机构伦理审查委员会批准。乳腺肿瘤患者的诊断及分期均经本院病理学确诊，并进行了雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)等免疫组化检测。排除标准：①合并有肝肾功能不全者；②合并有其他肿瘤患者；③合并有造血系统异常及重症感染者；④依从性差或者有精神疾病患者。

1.2 实验的主要仪器与试剂 台式高速冷冻离心机和RNA浓度检测仪均为赛默飞世尔科技公司产品；逆转录仪采用的是美国Labnet PCR仪；荧光定量PCR仪为ABI 7500系统 (Life Technology，美国) 。血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(版本号：DP171207，目录号：DP503)、miRNA cDNA合成试剂盒(版本号：KR171206，目录号：KR211)及miRNA荧光定量PCR试剂盒(版本号：FP180328，目录号：FP411)均购自天根生化科技(北京)有限公司；miRNA-222和miRNA-21以及内参U6的引物均由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 血清miRNA的提取和分离 miRNA的分子量小，是一种非编码RNA；加入氯仿使血清中的蛋白质变性，高速离心使水相和有机相快速分离，RNA进入水相进而与蛋白质分离；无水乙醇可将RNA沉淀到吸附柱内，再经过多次特殊的漂洗、离心过程，杂质可被充分去除，最后用双蒸水将纯净的RNA从吸附柱中洗脱。

1.3.2 miRNA的逆转录或cDNA的合成 根据试剂盒说明书严格配制miRNA的逆转录反应体系并设置逆转录仪的运行程序，然后进行逆转录。

1.3.3 RT-PCR检测目的基因的相对表达水平 miRNA-222上游引物是5′-GTTCGTGGGAGCTACATCTGGC-3′，下游引物是5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；miRNA-21上游引物是5′-TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT-3′，下游引物是5′-CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATT-3′；内参U6上游引物是5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物是5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。将混匀的目的基因反应液和内参反应液各加入到3个PCR板孔中，按试剂盒说明书上的PCR 反应程序进行扩增。反应完毕后拷贝PCR仪的检测结果，即目的基因miRNA-222、miRNA-21及内参基因U6的Ct值，在软件Excel中运用 2^( -ΔΔCT)法计算两种miRNA的相对表达量。

1.4 观察指标 ER、HER-2、PR阳性阴性判定标准是采用免疫组织化学法(IHC)检测乳腺癌病灶组织中三种受体阴阳性，ER、PR以细胞核可见棕黄色颗粒为阳性染色， 将>1%阳性细胞数判定为阳性表达；HER-2以细胞膜可见棕黄色颗粒为阳性染色，将>10%阳性细胞数判定为阳性表达。而淋巴结转移判定标准则依据手术后，对腋窝的淋巴结进行病理学检查，若确诊为乳腺癌或乳腺恶性肿瘤则为淋巴结转移。

1.5 统计学方法 运用SPSS 20.0统计学软件进行统计处理。三组血清miRNA-222、miRNA-21表达水平的比较是计量资料，数据不符合正态分布，以M(P25～P75)表示，采用非参数K个独立样本Kruskal-WakkisH检验，两两比较采用Mann-WhitneyU检验。将乳腺癌组和乳腺良性肿瘤组的血清miRNA-222、miRNA-21水平做ROC曲线分析。乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同临床参数及免疫组化指标中表达的比较，数据不符合正态分布，以M(P25～P75)表示，采用2个独立样本非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清miRNA-222、miRNA-21相对表达量的比较 三组血清miRNA-222、miRNA-21相对表达量比较总体上差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，乳腺癌组、乳腺良性肿瘤组的miRNA-222相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但是乳腺癌组的miRNA-222相对表达量和乳腺良性肿瘤组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，乳腺癌组的miRNA-21相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)，乳腺癌组miRNA-21表达量高于乳腺良性肿瘤组，差异有统计学意义(P<0.05)，对照组的miRNA-21与乳腺良性肿瘤组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组血清中的miRNA-222、miRNA-21相对表达量的比较

2.2 血清miRNA-222、miRNA-21检测对乳腺癌诊断的作用分析 将乳腺癌组和乳腺良性肿瘤组的血清miRNA-222、miRNA-21水平作ROC曲线分析，miRNA-21的曲线下面积为0.665>0.5，而且P<0.05，说明miRNA-21对于诊断乳腺恶性病变具有显著的意义，最大约登指数为0.295，当临界值为0.693，敏感度为85.71%，特异度为43.75%。miRNA-222的曲线下面积为0.465<0.5，且P>0.05，说明miRNA-222对于诊断乳腺恶性病变不具有统计学意义。见图1、表2。

图1 血清miRNA-222、miRNA-21诊断乳腺癌的ROC曲线

表2 血清miRNA-222、miRNA-21诊断乳腺癌的ROC曲线下面积

2.3 乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同临床参数及免疫组化指标中的表达对比 有淋巴结转移的乳腺癌患者的miRNA-222、miRNA-21表达水平高于无淋巴结转移乳腺癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。按照年龄、肿瘤直径、ER、PR、HER-2分组比较乳腺癌患者的miRNA-222、miRNA-21表达水平，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 乳腺癌患者血清miRNA-222、miRNA-21在不同临床参数及免疫组化指标中的表达对比

3 讨论

Esplugas R等[13]研究发现miRNA-222在乳腺癌患者放疗前的外周血中是过表达的。Chan M等[14]研究发现在乳腺癌患者肿瘤组织中有20种miRNAs的表达相对于正常组织是失调的，然而仅有miRNA-21等7种miRNAs的水平在患者肿瘤组织和血清中都是升高的，这表明miRNAs可能被选择性地释放到血清中。本文研究结果提示乳腺癌患者的血清miRNA-222、miRNA-21相对于正常人是过表达的。本研究结果还显示乳腺良恶性肿瘤患者组血清miRNA-222相对于对照组均是过表达的，但乳腺良、恶性肿瘤患者组之间的差异不显著；血清miRNA-21仅在乳腺癌患者组是过表达的，其水平在乳腺良性肿瘤患者组与对照组之间无明显差异。

为了评估血清miRNA-222、miRNA-21检测在乳腺癌诊断方面的效能，我们将乳腺癌组和乳腺良性肿瘤组的血清miRNA-222、miRNA-21水平作ROC曲线分析，结果提示血清miRNA-21作为诊断乳腺癌的指标，其ROC曲线下面积为0.665，P值为0.020，且当血清miRNA-21的临界值为0.693时，其敏感度和特异性分别为85.71%、43.75%，这说明血清miRNA-21可以作为乳腺癌监测的一个辅助诊断指标，具有一定的参考价值；而血清miRNA-222的ROC曲线下面积仅为0.465，P值>0.05，说明对早期乳腺癌的监测缺乏价值。

近来研究表明[15-19]：miRNA-222、miRNA-21可以促进乳腺肿瘤的生长并抑制细胞凋亡，还可以调控乳腺癌细胞的运动进而促进其迁移和侵袭。本研究按照有无淋巴结转移将乳腺癌患者的血清miRNA水平分为转移组和未转移组，经过统计分析得出：乳腺癌患者的淋巴结转移会影响其血清miRNA-222及miRNA-21的相对表达水平。这提示miRNA-222及miRNA-21可能参与介导乳腺癌细胞的淋巴结转移过程。

本研究结果揭示：miRNA-222、miRNA-21在乳腺癌患者的血清中是过表达的，均明显高于正常人；血清miRNA-21具有较好的特异性，有望成为乳腺癌诊断的生物学标记物，而且乳腺癌患者血清miRNA-222及miRNA-21水平可能与淋巴结转移有关。所有相关研究结果表明miRNA可作为一种新型的生物学标记物，在针对肿瘤的增殖、侵袭、转移、耐药、复发等现象发生的研究中具有一定的应用价值和广泛的应用前景。