大狼毒根部乙酸乙酯萃取物抑菌活性及急性毒性作用

李志玲 ， 项 勋 ， 刘清琦 ， 段 纲 ， 常 华 ， 杨林富

(云南农业大学动物医学院 ， 昆明 云南 650201)

大戟属(Euphorbia)为大戟科(Euphorbiaceae) 中最大的属，全世界共有2 000 余种，其中有80余种分布在我国，以西北和西南横断山区较多[1-2]。大戟属药用植物常常用于治疗关节炎、水肿、结核、牛皮癣、疥疮、无名肿毒等疾患[3]。该属植物主要含有萜类、黄酮类、鞣质类等成分,具有抗肿瘤、抗白血病、抗病毒、抗菌、抗炎、镇痛、泻下、抗生育、保肝、抗氧化等活性[4-5]。

大狼毒(EuphorbiajolkiniiBoiss.)是大戟属多年生草本植物，其根入药，具有止血、消炎、祛风、消肿等功效[6-7]，作为一种生长于滇西亚高山草甸的典型毒害草，大狼毒可致草地退化，家畜误食后中毒[8]。大狼毒的化学成分主要为二萜、三萜、甾体、鞣质等，具抗肿瘤、抗癌、抗病毒、保肝及诱导肝细胞分化等作用。同属植物狼毒大戟富含丰富的二萜类成分，且部分化学成分在大狼毒中亦有发现；这些二萜类化合物具有抑制多种癌细胞生长、抗人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)作用以及抑制结核杆菌细胞壁的形成等药理活性[9]，此外还有报道发现，狼毒大戟的石油醚及乙酸乙酯提取物具有一定毒性，这些研究都为该属植物的进一步研究和开发提供了依据。但目前关于同属植物大狼毒地下部分的抑菌活性及毒性研究尚无文献报道。本试验对大狼毒根部95%乙醇提取物的萃取相抑菌活性进行评价，并选取活性最好的乙酸乙酯萃取物进行急性毒性作用的研究，为兽医开发大狼毒地下部分资源提供药理学和毒理学资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物及菌株 SPF级昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由云南省昆明医科大学动物实验部提供,实验动物生产许可证号：SCXK(滇)2015—0002。在温度(22±3) ℃，相对湿度40%～60%的动物房中适应性饲养5 d，食用标准饲料，自由饮水。

本试验使用的菌株为购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心的金黄色葡萄球菌(CVCC1882)和猪霍乱沙门菌(CVCC2139)。

1.2 药材及试剂 大狼毒根部采自云南香格里拉，由云南农业大学动物医学院药理实验室鉴定。95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、DMSO，均购自昆明普罗米商贸有限公司。细菌培养用酵母提取物及胰蛋白胨等，均购自海博生物技术有限公司。庆大霉素试纸及空白药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大狼毒提取方法 先将大狼毒根部清洗干净、切片、晒干后粉碎成400目粉末，使用95%乙醇溶液对2 kg大狼毒根部粉末分5次进行冷浸提取，将药液利用旋转蒸发仪负压浓缩，获得总浸膏308 g(约为生药含量的15.4%)。

采用液液萃取法，分别用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯溶液依次萃取3次，将所得到的萃取物放置在60 ℃的恒温烘箱中烘干，称重。再用丙酮将萃取相配置成10 mg/mL浓度的药液，取10片空白药敏纸片放入装有10 mL药液的小瓶子，37 ℃烘箱烘干，含药量为10 mg/片。

1.3.2 抑菌试验 将处于生长对数期的金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门菌以1×107CFU/mL的浓度，均匀涂布于LB培养基上后，将空白对照的空白药敏纸片、阳性对照的庆大霉素药敏纸片和各相药敏纸片等距贴于平板上，放入37 ℃恒温培养箱内，培养12 h后测量各抑菌圈直径，选择抑菌效果最好的萃取相做3次平行抑菌效果评价。

用倍比稀释法测定大狼毒根部乙酸乙酯萃取物的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration，MIC)。试验组为1～9号，用生理盐水将乙酸乙酯萃取物稀释成浓度为10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL和0.039 mg/mL的药液，每组取1 mL药液加入含相同细菌数的5 mL LB培养基，培养16～24 h，观察培养基的浑浊程度，重复试验3次，取其平均值。

1.3.3 受试物处理及急性毒性试验

1.3.3.1 受试物的处理 称取大狼毒根部95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相50 g，用10%的DMSO配制成浓度为0.3 g/mL的悬浮液，超声辅助溶解，现用现配。

1.3.3.2 急性毒性试验 试验根据GB15193.3—2014《急性经口毒性试验》中寇氏法进行设计。首先，进行预试验筛选出试验的最高和最低剂量。将20只昆明小鼠随机分成5组，每组4只，在尾部标记编号，单笼饲养，试验前禁食6 h，不禁水。大狼毒根部乙酸乙酯萃取物药液(用10%DMSO作为溶剂溶解)剂量组：1 000、2 000、4 000、6 000 mg/(kg·bw)和8 000 mg/(kg·bw)；试验开始后于24 h内分3次灌胃给药，每次灌胃体积不超过0.40 mL/只。给药后连续观察7 d，观察小鼠毒性反应情况。若试验中有小鼠死亡，则按照给药剂量估计出小鼠全部死亡或90%以上死亡剂量和不死亡或10%以下死亡剂量，并将这2个剂量分别作为最高剂量[8 000 mg/(kg·bw)]和最低剂量[2 000 mg/(kg·bw)]。

正式试验中将36只昆明小鼠随机分成6个组(A～E组试验组，F组对照组)，每组6只，等对数间距设置5个剂量水平，分别为：A组[2 000 mg/(kg·bw)]、B组[2 828 mg/(kg·bw)]、C组[4 000 mg/(kg·bw)]、D组[5 655 mg/(kg·bw)]、E组[8 000 mg/(kg·bw)]，F组灌胃等体积的10%DMSO(DMSO为溶剂)。灌胃给药后12 h内观察小鼠饮食、呼吸、行为、精神状态是否异常，有无中毒症状或死亡现象等。若观察期内发现有动物死亡，立即剖检，肉眼观察各脏器变化，采集有明显病变组织做病理切片；未死亡动物在14 d观察期结束后颈椎脱臼处死，并对处死小鼠进行剖检后肉眼观察脏器有无异常变化，并对异常脏器进行组织病理学观察研究。

1.3.3.3 计算半数致死量 根据GB15193.3—2014《急性经口毒性试验》中寇氏法计算相关公式算出大狼毒根部的乙酸乙酯萃取物的半数致死量(Median lethal dose，LD50)，公式如下：

式(1)

标准误：

式(2)

95%可信限：

式(3)

其中：Xi+Xi+1为相邻2个组的剂量对数之和；Pi+Pi+1为相邻2个组动物死亡百分比；d为组距；n为样本量。

2 结果

2.1 大狼毒根部萃取物抑菌作用 由图1可知，3号乙酸乙酯相和5号庆大霉素的抑菌圈较大，而1号氯仿相和2号石油醚相抑菌圈不明显；由表1可知，抑菌效果最好的乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门菌的抑菌平均直径值为1.7 cm和1.6 cm(注：其中庆大霉素药敏纸片含药量为10 μg/片,大狼毒根部萃取相药敏纸片含药量为10 mg/片)，且对2种细菌的MIC分别为1.25 mg/mL和2.5 mg/mL。

图1 大狼毒根部萃取相抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of each extract from the root of Euphorbia jolkini BoissA:猪霍乱沙门菌; B:金黄色葡萄球菌; 1：石油醚相; 2：氯仿相; 3：乙酸乙酯相; 4：空白对照； 5：庆大霉素A:Salmonella cholerae-suis; B:Staphylococcus aureus; 1:Petroleum ether phase; 2:Chloroform phase; 3:Ethyl acetate phase; 4:Blank control; 5:Gentamicin

表1 药敏纸片琼脂扩散法抑菌直径Table 1 Antibacterial diameter of antimicrobial susceptibility test (cm)

2.2 急性毒性试验及LD50测定 经口给药后，低剂量组(A组和B组)小鼠能在10 min内恢复正常行动，高剂量组(D组和E组)小鼠30 min内均出现中毒症状，闭眼蜷缩于角落，呼吸急促，对外界声音刺激反应迟钝。最高剂量E组[8 000 mg/(kg·bw)]小鼠在24 h内全部陆续死亡；D组[5 655 mg/(kg·bw)]中3只小鼠在中毒后第3天死亡，其中1只不断抽搐，头颈后仰，挣扎至死；而C组[4 000 mg/(kg·bw)]和B组[2 828 mg/(kg·bw)]小鼠中毒症状不明显，分别于第3天各死亡3只和1只；而最低剂量A组[2 000 mg/(kg·bw)]和F组小鼠除灌胃24 h后体重有所下降外，并未出现死亡。除去各组死亡小鼠，其余小鼠在14 d内未出现中毒症状和死亡的情况。

表2 急性毒性试验小鼠死亡情况Table 2 Mice death details of acute toxicity test

经计算，大狼毒根部的乙酸乙酯萃取相的LD50为4 229.607 mg/(kg·bw)，95%置信区间为3 405.807～5 252.669 mg/(kg·bw)。

2.3 内脏病理变化 对各剂量组死亡小鼠进行剖检后均发现小鼠的胃肠严重鼓气，指尖触摸肠内粪便坚硬，但脱臼处死的高、中、低剂量组小鼠胃肠道肉眼观察未见明显异常；各组死亡小鼠的肝脏浊肿，有明显的暗红色淤血斑及针头大小的出血点，其余脏器肉眼未见明显病变。

采集对照组小鼠和试验组死亡小鼠的肝脏进行病理组织学变化观察，结果如图2所示，对照组小鼠无论在低倍镜或高倍镜下肝小叶结构完整，肝细胞呈条索排列整齐，形态无异常；而低倍镜下可见试验组的小鼠肝小叶结构不完整，汇管区毛细血管充满了红细胞，高倍镜下肝小叶中央静脉及其周围肝血窦扩展，充满了红细胞，肝细胞肿胀发生空泡变性，胞浆出现淡红色颗粒状，变性严重细胞核被水泡挤至细胞一侧，胞浆空白。

图2 小鼠肝脏切片(H.E.染色,400×)Fig.2 Liver sections of mice (H.E.staining，400×)A:对照组； B、C:试验组； 黑色箭头：水泡变性； 黑色圆圈和方框：空泡变性及肝血窦扩张； 红色箭头和红线：炎性细胞浸润A:Control group; B,C:Experience group; Black arrows:Vesicular degeneration; Black circles and boxes:Vacuolar degeneration and hepatic sinusoidal dilatation; Red arrows and red lines:Inflammatory cell infiltration

3 讨论

大戟属大狼毒地下部分化学成分丰富，其中不同骨架型的二萜类化合物具有分类学意义。据有关文献报道，其单体成分的分离方法各异，且具有多生物学活性。日本名古屋大学化学研究所[11-13]在1972—1976年通过高速液相色谱柱层析法，从日本产大狼毒根部的甲醇提取物的苯萃取物中相继分离得到松香烷型二萜Jolkinolides A、B、C、D和E以及千金子烷型二萜Jolkinols A、B、C和D。20世纪90年代，中国学者从大狼毒根部95%乙醇提取物的石油醚、苯、乙醚和乙酸乙酯萃取物中又发现了多个二萜、三萜和甾体类化合物[14-16]。2004年，Lee等[17]从大狼毒全株的80%丙酮水提取物中分离得到一种单宁，命名为Jolkinin。2013—2017年，国内研究人员又从其根部的乙醇提取物中分离出更多的二萜、三萜、苯丙素类、甾醇及鞣质类化合物，丰富了大戟科植物中二萜的骨架类型。本试验研究对象是大狼毒根部95%乙醇提取物，并依极性萃取的各相萃取物，结合前人研究猜测本次提取的乙酸乙酯萃取相的成分富含二萜类化合物。

此外，前人对大狼毒化学成分的生物学活性研究包括了抗病毒、抗肿瘤、抗氧化作用等。Ito等[18]分离的3,3-di-O-methylellagic acid具有清除自由基和抑制脂质过氧化的作用，可减轻四氯化碳引起的小鼠肝脏损伤。抗病毒研究方面，研究发现大狼毒中Putranjivain A主要影响HSV-2体外感染晚期阶段，可抑制病毒的附着和渗透[19]，而Jolkinol A也具有明显的抗RSV活性[20]。近20年，学者们在大狼毒抗肿瘤化学成分方面亦有研究，发现Jolkinolide D可抑制肿瘤侵袭基底膜，诱导人白血病HL-60肿瘤细胞凋亡[21]，Jolkinolide F对HL-60细胞和Hela细胞有细胞毒性[22]，6-O-咖啡酰基-16-羟基十六烷酸对MCF-7细胞和Hela细胞有轻微细胞毒性[23]。陈颖志[24]从大狼毒中分离的化合物对β-羟高铁血红素的形成有较好的抑制作用，并推断其中的三萜类化合物是大狼毒的抗疟成分。

目前，鲜有大狼毒毒理学方面的研究报道。1994年，Wu等[25]从云南产大狼毒根乳汁中的丙酮提取物中分离得到2种巨大戟型二萜酯的混合物，其对小鼠耳部皮肤具有刺激性。但近几年研究人员推测其巴豆烷型二萜可能与之毒性和刺激性有关。2000—2013年，先后有狼毒大戟毒理学研究报道，其水煮滤液可致小鼠精子畸形，有明显的致突变作用[26]，其超临界二氧化碳萃取物的LD50为2.05 g/(kg·bw),属于小毒物质[27]，而其石油醚提取物和乙酸乙酯提取物的LD50为31.03 mg/(kg·bw)和1 538.58 mg/(kg·bw)[28]。由此可见，狼毒大戟的毒性与其提取方式不同有关。本试验中大狼毒乙酸乙酯萃取物的半数致死量接近5 000 mg/(kg·bw)，相对狼毒大戟乙酸乙酯部的毒性较小，这可能是二者乙酸乙酯萃取物的成分差异所致。

本试验发现，大狼毒根部的乙酸乙酯萃取物具有较好的抑制金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门菌的作用，且一定剂量的该萃取物可至小鼠胃肠道严重胀气，肝脏损伤作用甚至是死亡，但本试验仅选择了对畜禽疾病危害较重的菌株进行抑菌活性的研究，大狼毒乙酸乙酯萃取物及其单体化合物的抑菌谱还有待进一步探究。同时，本试验结果可指导大狼毒根部的抗菌单体化合物的分离及纯化，为开发这种有毒但二萜类化学成分丰富的植物提供了药理学及毒理学试验基础和数据支撑。