复方肠泰抑制新生血管生成的实验研究

刘静冰 李灵常 魏国利 吴夏慧 李检阅 霍介格

（南京中医药大学附属中西医结合医院肿瘤科，江苏南京210028）

肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，据《2015年中国癌症数据》报道，2015 年我国结直肠癌患者新增人数超过37 万人，死亡超过19 万人，发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中居第五位[1]。中医药在结直肠癌的治疗中发挥着日益重要的作用。复方肠泰系我院肿瘤科治疗结肠癌的经验方，由人参、薏苡仁、白花蛇舌草、莪术、八月札和藤梨根等六味中药组成。人参中的人参皂苷Rg3 是重要的抗血管生成因子，可抑制肝癌、结肠癌等多种肿瘤的新生血管生成[2-3]。课题组前期研究发现，复方肠泰通过半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）诱导结肠癌细胞SW480 凋亡，诱导自噬体活化巨噬细胞而促进抗肿瘤免疫应答，诱导HT-29 移植瘤细胞自噬和凋亡，抑制裸鼠移植瘤生长[4-5]。因此，我们推测复方肠泰可能具有抗新生血管生成作用，并与其抗结肠癌作用相关，故本研究以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和SCID小鼠为研究对象，探索复方肠泰对新生血管生成的影响。

1 实验材料

1.1 细胞和实验动物 HUVEC：产品编号H-007F-C，澳赛尔斯生物科技（上海有限公司）。雄性SCID小鼠：SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK（沪）2017-0005。本研究动物伦理备案号：AEWC-20181020-55。

1.2 药物与试剂 复方肠泰，处方：人参10 g，黄芪15 g，藤梨根15 g，薏苡仁20 g，苦参6 g，八月札10 g。加10倍体积水浸泡30 min后煮2 h，药渣加8倍水再煮2 h，煎煮液100目筛网过滤，冷却后2次滤液经蒸发仪浓缩至220 mL，作为饮片水煎液，生药浓度2.50 g/mL。加磷酸缓冲盐溶液（PBS）于离心半径8 cm，10 000 r/min离心10 min后取上清液，根据不同浓度需要加入一定量的PBS稀释，使用滤器过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。

内皮细胞培养基（ECM）：货号1001，品牌ScienCell，产地美国，规格500 mL，北京索莱宝科技有限公司。无血清培养基（SFM）：货号17705-021，品牌Gibco，规格500 mL，南京信帆生物技术有限公司。CCK-8试剂盒：目录号M4839，品牌AbMole，规格5 mL，奥默生物科技（上海）有限公司。

1.3 主要实验仪器 滚筒式细胞培养装置，cell240，德国热电；台式高速离心机，TGL-16G，中国；台式低温冷冻离心机，5417R，德国Eppendorf；CO2培养箱，Heracell150，德国；生物安全柜，classⅡ，美国Labconco；荧光倒置显微镜，CKX41-F32FL，日本奥林巴斯；全波长酶标仪，Molecular Devices SpectraMax M5，美国。

2 实验方法

2.1 HUVEC细胞培养 HUVEC细胞置于ECM中培养，添加1%血管内皮细胞生长补充物、5%胎牛血清（FBS）及100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，置37 ℃、5%CO2饱和湿度的温箱中培养。

2.2 HUVEC划痕试验 HUVEC培养至90%融合，换至0.2%牛血清白蛋白（BSA）的SFM培养基中饥饿4 h，枪头在每孔中画线并加入生理盐水（对照组）和不同浓度的复方肠泰（10、20、40 mg/mL）培养0.5 h，每组设3个复孔；将每孔培养基换为10% FBS和相应浓度复方肠泰继续培养24 h；每孔置于倒置显微镜（×100）下拍照，采用图像分析软件Image-Pro Plus分析每孔细胞发生迁移前后照片，计算损伤后细胞迁移到损伤部位的细胞数。试验重复3次。

2.3 HUVEC CCK-8试验 HUVEC以3.5×103/孔接种于96孔板中过夜，饥饿4 h后用生理盐水（对照组）和不同浓度的复方肠泰（10、20、40 mg/mL）培养1 h，每个浓度设3个复孔。将培养基换成含相应浓度的复方肠泰和2% FBS的SFM，分别继续培养12、24或48 h后，加入CCK-8孵育4 h。酶标仪检测各孔450 nm处吸光值（A），增殖抑制率=（A阴性对照-A样品）/（A阴性对照-A空白对照）×100%。试验重复3次。

2.4 HUVEC小管形成试验 HUVEC加入铺好Matrigel的96孔培养板中，加入生理盐水（对照组）和不同浓度的复方肠泰（10、20、40 mg/mL），每个浓度设5个复孔，放入37 ℃培养箱中孵育24 h。将每孔置于倒置显微镜（×100）下拍照，图像分析各孔形成小管的数量。试验重复3次。

2.5 SCID小鼠Matrigel栓试验 将20只6周龄雄性SCID小鼠随机分为4组，每组5只。每只小鼠背部左侧皮下注射GFR-Matrigel混合物400 μL，背部右侧皮下注射Matrigel混合物400 μL。第2日开始每组小鼠予生理盐水（模型组）和不同浓度的复方肠泰（13.90、27.80、55.60 g/kg）灌胃，每日1次，每次0.2 mL。连续灌胃7 d后处死小鼠，取出背部Matrigel栓。各组胶栓在离心管中剪碎，加入RIPA裂解液500 μL，离心后取上清200 μL/样本，移入96孔酶标板中，酶标仪415 nm波长读取血红蛋白A值。

2.6 统计学方法 使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据以（）表示。多组间比较采用ANOVA分析，2 组间比较采用t检验，P＜0.05为具有显著性差异。

3 实验结果

3.1 复方肠泰对HUVEC迁移能力的影响 在划痕试验中，复方肠泰组HUVEC细胞划痕间伤口愈合距离百分比低于对照组，说明复方肠泰能抑制HUVEC向损伤部位迁移（图1）。迁移量化分析显示（图2），与对照组比较复方肠泰各剂量均能明显抑制HUVEC迁 移（P＜0.05），复 方 肠 泰10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL组的迁移抑制率分别为23.46%、45.64%和67.52%，40 mg/mL组抑制率显著高于10 mg/mL和20 mg/mL组（P＜0.05），其抑制作用具有浓度依赖性。

3.2 复方肠泰对HUVEC增殖的影响 CCK-8检测结果表明：同一作用时间下，随复方肠泰浓度增加，细胞增殖抑制率升高；而在同一作用浓度下，随作用时间延长，增殖抑制率升高。说明复方肠泰能抑制HUVEC增殖，且具有浓度和时间依赖性。见图3。

3.3 复方肠泰对HUVEC小管形成的影响 复方肠泰能够抑制HUVEC在Matrigel上形成网状小管结构。10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL复方肠泰的小管抑制率分别为38.89%、72.22%和88.89%（P＜0.05），说明复方肠泰能抑制HUVEC小管形成并有浓度依赖性，见图4。

3.4 复方肠泰对SCID小鼠皮下移植matrigel栓中血红蛋白含量的影响 Matrigel栓试验结果显示，小鼠予13.90、27.80、55.60 g/kg复方肠泰灌胃后，皮下移植的matrigel栓中血红蛋白含量分别为（0.81±0.04）μg/mg、（0.47±0.02）μg/mg和（0.28±0.01）μg/mg，明 显低于对照组（P＜0.05）；且复方肠泰55.60 g/kg组matrigel栓中血红蛋白含量亦明显低于复方肠泰13.90 g/kg和27.80 g/kg组（P＜0.05）。说明复方肠泰对SCID小鼠体内的血管新生有明显的抑制作用，该作用有浓度依赖性。见图5。

图1 各组HUVEC迁移能力比较（×100）

图2 各组HUVEC迁移抑制率比较

图3 各组HUVEC增殖抑制率比较

图4 复方肠泰对HUVEC小管形成的影响（×100）

图5 各组Matrigel栓中血红蛋白含量比较

4 讨论

肠癌可归属于中医学“癥瘕”“积聚”“肠覃”“锁肛痔”等范畴。李东垣《脾胃论》云：“脾胃元气既伤，元气亦不能充，而诸病之所由生也。”明代《外科正宗》载：“蕴毒结于脏腑，火热流注肛门，结而为肿，其患痛连小腹，肛门坠重，二便乖违，或泻或秘，肛门内蚀，串烂经络，污水流通大孔……凡犯此未得见其有生。”肠癌病机总属本虚标实，本课题组将其总结为“脾虚是结直肠癌发病的基础，湿热瘀毒互结是发病的关键”[6]，治疗当以益气健脾、清热解毒、活血化瘀、消肿止痛为主。复方肠泰方中人参益气健脾、扶正固本，薏苡仁健脾化湿，白花蛇舌草清热解毒，莪术活血化瘀、消肿散结，八月札和藤梨根行气活血、消积止痛。在临床应用中，复方肠泰联合化疗能显著改善肠癌患者临床症状和生活质量，提高CD3+和CD4+淋巴细胞计数，提高结肠癌患者体力状况和免疫状态，起到减毒增效作用[7]。

20世纪70年代，哈佛大学的Folkman教授首次提出“肿瘤血管生成”的概念，认为肿瘤新生血管为肿瘤生长提供营养，迂曲的血管造成局部缺氧微环境甚至诱导耐药，脱落的癌细胞通过循环运送至全身导致转移[8]。血管新生是一个多步骤的过程，血管内皮细胞首先迁移到靶部位，黏附到组织后细胞开始增殖，增殖后的内皮细胞会形成网状的小管样结构。HUVEC是用胶原酶消化脐带静脉所得的血管内皮细胞，具有高活性、高纯度、可在体外培养的优点[9]，常常作为抗血管生成研究的良好研究对象。本研究我们通过划痕试验、CCK-8和小管形成试验，发现复方肠泰可以显著抑制HUVEC的迁移、增殖和小管形成。Matrigel是一种可溶的肿瘤基底膜提取物，含有丰富的促血管新生物质，在室温下凝固重新构成基底膜。因而将Matrigel注射到小鼠皮下形成Matrigel栓模拟肿瘤基质诱导新生血管生成，而通过检测Matrigel栓中的血红蛋白量可反映含有血流的血管数，从而间接反映新生血管生成的能力。本研究将Matrigel注射到SCID小鼠皮下形成Matrigel栓，小鼠予复方肠泰灌胃后可以看到Matrigel栓中血红蛋白量明显低于模型组，从而证明复方肠泰在体内可以抑制新生血管生成。

既往大量研究表明，中医药具有抗血管生成作用。薏苡仁注射液、人参皂苷Rg3以及某些中药复方能降低肿瘤微血管密度，下调血管内皮生长因子（VEGF）等促肿瘤血管生成因子的表达，对肿瘤血管生成具有抑制作用[10-12]。人参中的人参皂苷Rg3通过降低肿瘤细胞分泌的VEGF来抑制肿瘤新生血管生成[13]，通过减少肿瘤细胞分泌金属基质蛋白酶-9（MMP-9）来抑制血管内皮细胞的增殖和迁移[14]。本研究结果表明，复方肠泰具有抗新生血管生成作用，为进一步开展Ⅲ期临床研究和扩大临床应用增加了基础研究的支撑，另外也说明中药复方的抗肿瘤作用不像西药那样单一，具有泛靶点、多机制的特点，因而不容易出现耐药。

综上所述，复方肠泰在细胞水平能抑制HUVEC与新生血管生成相关的多步骤的生物学行为，包括HUVEC的迁移、增殖和小管形成，在动物水平能显著抑制SCID小鼠体内的血管新生，据此推断复方肠泰能抑制新生血管生成。课题组后续将以荷结肠癌小鼠为研究对象，进一步研究复方肠泰对小鼠结肠癌新生血管的影响，及其涉及的信号通路和抗血管生成的具体机制。