环孢素A用于治疗体外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者原因不明反复着床失败（RIF）的临床观察

马玲，郑小挺，杨丽娟，李琳，梅金凤，范荷花（南昌市生殖医院，江西 南昌 330004）

反复着床失败(RIF)至今没有明确的诊断标准，一般认为：移植3次及3次以上或移植10个以上胚胎或4个以上的优质胚胎均未能妊娠者，约占ART的10%，是IVF-ET中比较常见的问题，也是阻碍妊娠率提高的瓶颈问题［1］。如何改善这类患者的治疗结局，提高着床成功率一直是生殖专家和胚胎学家探讨的热点问题。环孢素A（CsA）是一种广泛应用于临床器官移植或自身免疫性疾病的免疫抑制剂。研究显示，CsA具有改善滋养层细胞生物学行为和诱导免疫耐受，从而改善妊娠结局［2］。因此，研究CsA在反复着床失败中的作用有助于为改善胚胎着床率提供新的治疗方法。环孢素A（CsA）是一种早在1978年就在临床器官移植后的免疫抑制剂，它使临床上器官移植取得划时代的进展，同时在治疗部分自身免疫性疾病方面也有一定的成效。CsA促进滋养细胞生物学功能且诱导母胎免疫耐受，同时CsA损伤DC细胞在中枢的迁移和成熟，诱导免疫耐受［3］。越来越多的证据表明，CsA不仅对免疫活性细胞有抑制作用，对多种类型细胞生物学功能具有调节作用（肿瘤细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、上皮细胞等）。因此本研究是基于环孢素对妊娠免疫与滋养细胞的双层调节作用这两点基础上进行的研究探索。基于以上工作基础，我们初步确定了CsA用于临床IVF-ET治疗RIF对胚胎的安全性，并预测其具有临床治疗的有效性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1月1～2021年7月在我院生殖医学科行IVF-ET的患者196例。随机分为试验组（服用环孢素A）102例和对照组（未服用环孢素A）94例。环孢素试验组中100例完成研究，2例取消移植（2例均因无可移植胚胎故取消）。对照组中91例完成研究，3例取消移植（1例因内膜＜7mm原因取消移植，2例因无可移植胚胎取消）。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表

1。方案经我院医学伦理委员会审核批准。

表1 两组一般资料比较（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）

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1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）自愿参加本研究，同意按治疗方案用药及随访，并签署CsA使用知情同意书；（2）健康状况良好，临床体检和试验室检查无明显异常（D-二聚体，凝血四项，优生五项，抗核抗体，流产组套，狼疮因子，甲亢五项等）；（3）年龄在20~35岁的妇女；（4）移植3次及3次以上失败（或移植10个以上胚胎或4个以上的优质胚胎）；（5）内分泌指标基本正常；（6）磷脂抗体阴性；（7）TORCHIgM（-）；（8）夫妇双方染色体核型正常；（9）宫腔镜检查无异常；（10）男方无严重的少、弱精子症者。排除标准：（1）夫妻双方任何一方患有严重的精神疾患、泌尿系统急性感染、神经系统或心血管系统的较重疾病或其它性传播疾病；（2）女方有吸毒等严重不良嗜好；（3）任何一方接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用期；（4）曾患有或现患有CsA禁忌症（严重感染、肿瘤、免疫缺陷症、凝血功能障碍等）（5）对象要求终止治疗或研究人员决定终止治疗；（6）未按研究方案服药或随访，影响结果分析判断者。

1.3 方法 （1）试验组：胚胎移植后，按IVF-ET常规方案维持黄体，即取卵日开始维持黄体16天，肌注，每天60mg，同时口服CsA 100～150mg/d。＜50kg用药量为100mg/d；50～60kg用药量125mg/d；＞60kg用药量为150mg/d。使用CsA时机：鲜胚移植者在取卵后3日开始用CsA。F-ET者，人工替代周期者在使用黄体酮3日用CsA，自然周期者在排卵后3日用CsA。停药时间：移植后13日抽血查人绒毛膜促性腺激素（β-hcg）检验妊娠，未妊娠者停药。生化妊娠者继续用药至移植后1个月，直至B超证实宫内见孕囊，并观察到原始心血管搏动者，继续用药到移植后45天停药。诊断宫外孕或流产者停药。（2）对照组胚胎移植后，同试验组同样按IVF-ET常规方案维持黄体。

1.4 IVF-ET方案 自然周期用于平素月经周期规律，无排卵障碍，子宫内膜厚度无异常的患者。人工替代周期主要用于月经周期不规律，不规律排卵或子宫内膜有异常的患者。人工替代周期者一般于月经第五天开始服用戊酸雌二醇（补佳乐），共21天，最后10天加服黄体酮胶囊，连续三个周期。两种方案维持黄体方案均相同。即取卵日开始维持黄体16天（常规方案：黄体酮60mg肌注每天）。常规于取卵后第三天移植，常规移植2枚胚胎。注意若内膜＜7mm者、OHSS高危患者或HCG日血P＞4.77nmol/L者取消移植。胚胎移植日若有多余胚胎，则令患者签署胚胎冷冻知情同意书，若遗弃胚胎须签署胚胎遗弃同意书。移植后13天返院复查是否受孕，若妊娠则继续黄体支持至移植后60天，若未妊娠，须休息2～3个月方可再行IVF-ET或F-ET。

1.5 临床观察指标 比较两组间基本情况如患者年龄、体重指数（BMI）、移植次数、既往移植胚胎数、移植胚胎数、囊胚数及妊娠结局，如临床妊娠率、着床率、生化妊娠率以及继续妊娠率。

1.6 妊娠评价 （1）胚胎着床率=探及孕囊数/移植胚胎总数；（2）生化妊娠率=血HCG增高人数/移植病人数。（HCG增高指3日龄胚胎移植后14天、5日龄胚胎移植后12天血β-hcG≥25MIU/ml）；（3）临床妊娠率=探及孕囊的病人数/移植病人数；（4）继续妊娠率=临床妊娠超过20周病人数/移植病人总数。妊娠者胚胎移植45天B超查孕囊、胚芽，75天查胚胎顶臀长（CRL）、颈项透明带厚度NT。如妊娠过程中发生流产，尽量做胎儿染色体核型分析。

1.9 统计学处理 数据采用SPSS 21.0统计学软件进行处理。计量资料符合正态分布用±s表示，采用t检验，部分不符合正态分布的计量资料采用中位数（最大值-最小值）表示，用非参数检验。计数资料指标采用四格表，用率表示，采用χ2检验。检验水准为α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

两组患者临床妊娠率、胚胎着床率和生化妊娠率比较，试验组临床妊娠率和着床率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。试验组生化妊娠率高于对照组，但无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 两组患者临床妊娠率、胚胎着床率和生化妊娠率比较（%）

3 讨论

对于体外受精-胚胎移植患者原因不明的RIF，是辅助生殖助孕过程中的常见问题，目前国内外均没有疗效确切的治疗手段，无论是在在经济上还是精神上均给这些夫妇造成沉重的心理负担，因此提高此类患者的临床妊娠率是目前生殖领域专家研究的热点问题之一。反复着床失败与诸多影响因素有关，如解剖、染色体、内分泌失常、胚胎的遗传或发育异常、子宫内膜容受性、滋养细胞的生物学功能、免疫因素、年龄等有关。但因为胚胎着床是一个极为复杂且受到多种因素影响的过程，多数原因不明，因此很难明确每一位RIF患者的确切病因。对于RIF可以找到明确原因的患者可给予对症治疗，但对于原因不明的RIF的治疗目前还处于探索阶段，因此没有一种完全有效的治疗方法。

环孢素A是由11个氨基酸组成的环状多肽，属于强效免疫抑制剂。临床上主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排斥反应。它是土壤中一种真菌的活性代谢产物，主要通过与细胞浆内的环孢亲和素(Cyclophilin)结合，形成复合物，该复合物与钙调磷酸酶催化亚单位结合，抑制其去磷酸酶活性，从而有效抑制T细胞介导的细胞免疫应答。在临床上被广泛应用于防治器官移植后排斥反应和治疗某些自身免疫性疾病。有学者发现低浓度CsA（0.0001～1μmlo/L）能以浓度和时间依赖性的方式促进妊娠早期正常人滋养细胞的增殖，抑制滋养细胞的凋亡，并可促进滋养细胞的迁移和侵袭［4］。相反有学者指出高浓度CsA（10μmol/L）反而对滋养细胞起到抑制作用，同时CsA也可通过影响活性氧簇（ROS）的生成，抑制线粒体相关的凋亡信号通路，减少妊娠晚期滋养细胞的凋亡［5，6］。研究发现［7］CsA能够通过通路MAPK/ERK1/2从而促进滋养细胞MMP-9与MMP-2的基因转录，上调蛋白分泌的作用。MMP-9与MMP-2蛋白具有消化细胞外基质胶原的作用，二者主要功能是降解和重塑细胞外基质，继而有益于组织细胞融合，以上两种蛋白的表达水平对胎盘形成及子宫螺旋动脉的重塑密切相关，因此CsA促进滋养细胞的生物学作用，与上面这两种蛋白增加密切相关。李大金［8］研究组发现CsA诱导母体免疫系统对胚胎产生免疫耐受、纠正CBA/J×DBA/2流产小鼠（免疫性流产模型）胚胎吸收倾向的同时，具有促进滋养细胞增生和提高其侵蚀功能的作用。人类妊娠50~60天的绒毛经CsA处理后，滋养细胞增生活跃，MMP-9和MMP-2表达上调，actin基因表达上调［9］。以上证据均表明CsA对滋养细胞的这些作用提示它可能在辅助生殖技术中具有促进胚胎着床的潜在价值。

本研究得出的最终结论是试验组比对照组临床妊娠率（43%vs 27.47%）和着床率（27.66%vs 15.25%）均高，而且二者均有明显的差异（P＜0.05），生化妊娠率也高于对照组（46%vs 32.97%），但二者并没有明显的差别（P＞0.05）。

综上所述，试验组较对照组的临床妊娠率和着床率均高，因此针对原因不明的反复着床失败的女性，可以考虑优先选择应用环孢素。