具有沙门氏菌拮抗能力的植物乳杆菌益生特性评价

张甜甜，鹿 瑶，吕文亮，林显华，徐海燕，谷 巍

(山东宝来利来生物工程股份有限公司/山东省动物微生态制剂省级重点实验室，山东 泰安 271017)

畜牧养殖行业主要依赖抗生素来防治动物疾病，而抗生素的大量使用却引发了兽药残留、超级细菌的出现等问题[1]。随着人们对动物食品品质要求的提高、监管部门对兽药残留的严格控制，市场对安全、高效、低毒兽药的需求越来越高，微生态制剂的研究为开发绿色、安全、有效的抗生素替代产品奠定基础。乳杆菌属和双歧杆菌属及其他肠道微生物组中占优势的益生菌，已被证明可通过免疫刺激、营养竞争、抑制病原菌和产生抗菌物质来改变肠道微生物群落并降低动物疾病风险[2-3]。植物乳杆菌是益生菌中的主要候选菌株，因为它们具有抗多种病原体的抗菌活性、对胆汁和低酸碱度的耐受性以及对肠细胞的黏附性[4-6]。REN等[7]的研究结果表明，植物乳杆菌可促进幼稚T细胞分化(Th1)并参与免疫调节反应，具有预防和控制食源性疾病的潜力；SERVIN等[8]、HAMILTON-MILLER[9]的研究结果均表明，植物乳杆菌对沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌和螺杆菌等具有良好的拮抗作用；TARRAH等[10]研究发现，植物乳杆菌LSC3可有效地黏附在黏蛋白和肠细胞上。

针对鸡白痢沙门氏菌病，目前的益生菌产品以复合微生态制剂为主。李瑞香等[11]使用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等组成的复合微生态制剂预防雏鸡鸡白痢沙门氏菌病，雏鸡成活率可提高30%，其中的乳酸杆菌需要与多种其他菌种复配才能达到一定的防治效果。蔡荣等[12]使用地衣芽孢杆菌、发酵乳杆菌、黏性优杆菌、双叉双歧杆菌等组成的复合微生态制剂，可有效防治鸡白痢沙门氏菌病。益生菌的生物学特性研究是微生态制剂研制的重要基础性工作。为储备抗沙门氏菌病的候选菌株，从自贮存的益生菌中筛选具有良好鸡白痢沙门氏菌拮抗能力的乳酸菌，并评价其生长性能、酸碱耐受性、消化酶耐受性、肠道黏膜黏附能力、安全性、传代稳定性等益生性能，以期为益生菌株的工业化应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试培养基及缓冲液

MRS培养基[13]、LB培养基[14]、PBS缓冲液[15]、粪便培养基[16]均参照对应文献中方法配制。

1.2 供试菌株

乳酸菌BLCC2-0410、BLCC2-0154、BLCC2-0155、BLCC2-0107、BLCC2-0001、BLCC2-0112、BLCC2-0111、BLCC2-0092、BLCC2-0038，鸡白痢沙门氏菌BLCC8-0017、BLCC8-0098，均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心提供。

鸡白痢沙门氏菌CVCC537、CVCC533购买自中国兽医药品监察所。

1.3 供试粪便

样品取自泰安凤台农贸市场。

1.4 抑菌试验

采用牛津杯法[17]测定各益生菌株发酵液(均培养16 h)对鸡白痢沙门氏菌的体外抑菌效果。

1.5 植物乳杆菌BLCC2-0410与鸡白痢沙门氏菌的共培养试验

1.5.1 菌液的制备 将植物乳杆菌BLCC2-0410接种于MRS液体培养基中，37 ℃条件培养18 h，4 000 r/min离心5 min，获得的菌体用PBS重悬，并调整菌液OD600值为0.1，备用。

接种鸡白痢沙门氏菌CVCC533于LB液体培养基中，37 ℃恒温振荡器120 r/min培养18 h，4 000 r/min离心5 min，获得的菌体用PBS重悬，并调整菌液OD600值为0.1，备用。

1.5.2 共培养 将植物乳杆菌BLCC2-0410菌悬液与鸡白痢沙门氏菌菌悬液等体积混合，按1%(V/V)接种至半固体粪便培养基中，作为共培养组(RS组)；植物乳杆菌BLCC2-0410菌悬液与PBS等体积混合，以1%(V/V)接种至半固体粪便培养基中，作为植物乳杆菌BLCC2-0410培养组(R组)；鸡白痢沙门氏菌菌悬液与PBS等体积混合，以1%(V/V)接种至半固体粪便培养基中，作为鸡白痢沙门氏菌培养组(S组)。各组置于37 ℃摇床中120 r/min培养，于24 h进行鸡白痢沙门氏菌和植物乳杆菌BLCC2-0410的计数。

1.6 植物乳杆菌BLCC2-0410菌株的生物学特性测定

1.6.1 生长曲线的测定 将活化的菌液接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养，于不同的培养时间取样测定pH值以及活菌数，以培养时间为横坐标，相应活菌数的对数值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.6.2 耐酸性试验 将活化的菌液分别接种于pH值为2.5和3.0的MRS液体培养基中，以pH值6.0的MRS培养基为对照，37 ℃培养4 h，取样进行平板菌落计数，计算存活率。

存活率=(待测pH值的菌液活菌数/初始菌液活菌数)×100%。

1.6.3 胆盐耐受性试验 将活化的菌液分别接种于含0.1%、0.2%、0.3%禽胆盐的MRS培养基中，以不加禽胆盐的MRS培养基为对照，37 ℃培养4 h，取样进行平板菌落计数，计算存活率。

存活率=(待测胆盐含量的菌液活菌数/初始菌液活菌数)×100%。

1.6.4 消化酶耐受性试验 (1)人工消化液的制备：参照《中国药典》中人工胃液及人工肠液方法制备[18]。(2)益生菌菌液制备：取植物乳杆菌BLCC2-0410过夜培养液，离心收集菌体，使用无菌生理盐水复溶，稀释10倍备用。(3)消化酶耐受性试验：将制备的菌液1 mL与9 mL胃蛋白酶液混合，37 ℃静置培养，于0、2、4 h分别计数。将制备的菌液1 mL与9 mL胰蛋白酶液混合，37 ℃静置培养，于0、4 h分别计数。

1.6.5 肠道黏附试验 取12孔细胞培养板，每孔加0.5 mL黏液，4 ℃过夜固定后，每孔加0.5 mL无菌生理盐水洗涤2次，然后每孔加0.5 mL标记菌悬液。另以未加黏液的0.5 mL标记菌悬液作阳性对照，28 ℃孵育2 h。除阳性对照外，再用0.5 mL无菌生理盐水洗去未黏附的细菌。

收集吸出的悬液和每次的洗涤液，采用梯度稀释法进行菌体计数，计算出未黏附的总菌量，最后计算出该菌黏附的百分比。黏附率=1-(未黏附菌量/阳性对照)×100%。

1.6.6 植物乳杆菌BLCC2-0410安全性试验 引入健康海兰褐雏鸡，自0日龄开始，采用经口灌喂法给予受试菌液及生理盐水，灌喂量为0.5 mL/只，每天2次(早、晚各1次)，灌喂至10日龄。每天称量体质量。其中对照组雏鸡灌喂灭菌生理盐水，试验组雏鸡灌喂植物乳杆菌BLCC2-0410菌液，低剂量组和高剂量组分别灌喂活菌量为1.0×1010cfu/mL、1.0×1011cfu/mL的菌液。试验期间雏鸡自由采食，饲喂环境相同。观察雏鸡精神状态，记录雏鸡体质量及进食量、死亡情况，剖检观察肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器病变情况。

1.6.7 植物乳杆菌BLCC2-0410传代稳定性测定 将植物乳杆菌BLCC2-0410接种于MRS 液体培养基中，37 ℃培养16 h作为第1代菌液，以1%(V/V)比例接种于另一MRS液体培养基中，37 ℃培养16 h作为第2代菌液，如此连续接种传至第25代。对5代、15代、25代细菌培养物测试抑制CVCC533的性能，同时进行菌液计数并测定其pH值，记录结果。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛试验结果

从表1可以看出，植物乳杆菌BLCC2-0410对4株鸡白痢沙门氏菌均有抑制效果，且抑制效果最好，对CVCC537、CVCC533、BLCC8-0098的抑菌圈直径均在15 mm以上，对BLCC8-0017的抑菌圈直径也在11 mm以上，其他菌株对鸡白痢沙门氏菌抑菌圈较小，甚至无抑菌圈。由此可见，在9株乳酸菌中，植物乳杆菌BLCC2-0410对鸡白痢沙门氏菌抑制效果最好。

表1 益生菌株对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径

2.2 植物乳杆菌BLCC2-0410与鸡白痢沙门氏菌的共培养试验结果

如图1所示，植物乳杆菌BLCC2-0410与鸡白痢沙门氏菌共培养24 h，鸡白痢沙门氏菌数量降低了约3个对数值；共培养对植物乳杆菌BLCC2-0410的生长影响较小，与植物乳杆菌BLCC2-0410培养组相比，活菌数仅低0.4个对数值。

图1 共培养条件下鸡白痢沙门氏菌(A)和植物乳杆菌BLCC2-0410(B)的生长性能

2.3 植物乳杆菌BLCC2-0410的生物学特性

2.3.1 生长曲线的测定 如图2所示，植物乳杆菌BLCC2-0410接种后2 h即进入对数生长期，8 h即进入稳定期，11～12 h达到最高活菌数4.7×109cfu/mL，24 h后进入衰亡期。菌液发酵至16 h达最低pH值，为3.74。可见，植物乳杆菌BLCC2-0410生长性能良好，产酸性能强。

2.3.2 耐酸性试验结果 从表2可以看出，植物乳杆菌BLCC2-0410在pH值2.5和3.0的酸性环境培养4 h，存活率分别为33.1%、88.9%，说明该菌可耐受pH值2.5和3.0的酸性环境。

2.3.3 胆盐耐受性试验结果 从表3可以看出，植物乳杆菌BLCC2-0410在0.1%禽胆盐环境中培养4 h，存活率为97%。随着禽胆盐含量的增加，存活率下降，在0.2%、0.3%禽胆盐环境中培养4 h，存活率分别为31%和4%，但活菌数仍在1.0×106cfu/mL以上。由此可以看出，植物乳杆菌BLCC2-0410对0.1%～0.3%的胆盐环境具有一定的耐受能力。

图2 植物乳杆菌BLCC2-0410的生长曲线及pH值变化曲线

表2 植物乳杆菌BLCC2-0410耐酸性试验结果

表3 植物乳杆菌BLCC2-0410禽胆盐耐受性试验结果

2.3.4 消化酶耐受性试验结果 从表4可以看出，在胃蛋白酶液中处理2 h，植物乳杆菌BLCC2-0410存活率为78.6%，处理4 h存活率为34.3%；在胰蛋白酶液中处理4 h，植物乳杆菌BLCC2-0410存活率为77.8%。由此可知，植物乳杆菌BLCC2-0410对胰蛋白酶及胃蛋白酶均有较强的耐受性。

2.3.5 肠道黏附试验结果 植物乳杆菌BLCC2-0410对肠黏膜具有一定的黏附能力。阳性对照组菌液活菌数为3.3×108cfu/mL，未黏附的菌量为2.7×108cfu/mL。由此可知，植物乳杆菌BLCC2-0410对肠黏膜的黏附率为18.2%。

表4 植物乳杆菌BLCC2-0410消化酶耐受性试验结果

2.3.6 植物乳杆菌BLCC2-0410安全性试验结果 试验期间，高剂量组、低剂量组及对照组雏鸡精神状态良好，粪便形态无明显差异，各组雏鸡体质量及进食量无明显差异(图3、图4)，剖检观察肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均无肉眼可见病变。综上说明，在试验活菌含量范围内，植物乳杆菌BLCC2-0410对雏鸡是安全的。

图3 植物乳杆菌BLCC2-0410对雏鸡体质量的影响

图4 植物乳杆菌BLCC2-0410对雏鸡进食量的影响

2.3.7 植物乳杆菌BLCC2-0410传代稳定性试验结果 如图5所示，植物乳杆菌BLCC2-0410连续传5代、15代、25代细菌形态均为短杆菌，菌体大小均匀、形态单一。

图5 植物乳杆菌BLCC2-0410各代次的菌体形态

从表5可以看出，各代次菌液活菌含量、发酵液pH值以及对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径均差别不大。说明植物乳杆菌BLCC2-0410传代稳定性良好。

表5 植物乳杆菌BLCC2-0410的传代稳定性测定结果

3 结论与讨论

乳酸菌可以通过产生H2O2、抗菌素、有机酸等各种代谢产物来抑制致病菌的生长[19-23]。ZHANG等[1]的研究结果表明，乳酸菌可在体外有效抑制大肠杆菌和白痢沙门氏菌的生长。本研究结果显示，BLCC2-0410对3株鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径在15 mm以上，对另外1株沙门氏菌抑菌圈直径介于11～15 mm，与其他乳酸菌株相比，体外抑菌效果最好，且与鸡白痢沙门氏菌共培养可有效降低沙门氏菌的数量。大量研究表明，菌株生长得越快，越容易获得竞争优势[24-27]。本研究结果显示，植物乳杆菌BLCC2-0410在37 ℃培养2 h即进入菌株生长对数期，最高活菌数可达4.7×109cfu/mL，生长速度快，生长性能良好。植物乳杆菌BLCC2-0410发酵液最低pH值为3.74，显著低于靳胜男等[17]筛选出的乳酸菌发酵液pH值4.21，表明植物乳杆菌BLCC2-0410产酸性能相对良好。

益生菌能否通过胃肠道并发挥其益生作用，与其对胃肠环境的耐受性密切相关[28]。这些环境包括消化道中的酶、pH值和胆盐等。现有资料显示，禽类的胃内pH值为2.5～5.1[25]。植物乳杆菌BLCC2-0410在胃蛋白酶液中处理2 h，存活率78.6%，在pH值2.5和3.0时的存活率为33.1%、88.9%。本研究结果与郝露露等[29]的研究结果相似，菌株32E、B14、C24在pH值3.0的人工模拟胃液中处理3 h内存活率为80%以上。因此认为，植物乳杆菌BLCC2-0410能耐受鸡胃环境中的酸和消化酶的环境。消化道中的胆汁可以防止病原菌黏附到肠黏膜顶部并避免细胞损伤[30]，同时，也对乳酸菌的存活产生威胁。资料显示，禽肠道中的胆盐含量为0.03%～0.3%[31]。本研究中，菌株在胰蛋白酶液中处理4 h，植物乳杆菌BLCC2-0410存活率77.8%；随着禽胆盐含量的增大，存活率下降，在禽胆盐含量0.3%时，存活率为4%，但活菌数仍可在106cfu/mL以上。BEGLEY等[32]和LAHTEINEN等[33]的研究结果表明，乳酸菌若在肠道内发挥益生作用，其摄入肠道内的活菌含量需达到106～107cfu/mL。可见，植物乳杆菌BLCC2-0410能耐受鸡肠道中的胆盐及消化酶的环境。

乳酸菌对肠道的黏附有助于增强乳酸菌和肠细胞之间的信号交换，进而促进其在肠中的定植，并竞争性抑制病原体的定殖、提高机体免疫力[34]。因此，乳酸菌的黏附性是评估其用作益生菌的重要标准，已有资料证明乳酸杆菌具有与细菌病原体类似的表面黏附素[35]。一些表面定位的分子如脂磷壁酸、凝集素样分子和蛋白质，被鉴定为与宿主细胞表面上的特定受体相互作用的黏附素[8,36]。本研究中，植物乳杆菌BLCC2-0410对肠道具有一定的黏附能力，黏附率为18.2%。与郝露露等[29]的研究相比，黏附率略低，可能与菌株活菌含量、生长阶段、表层蛋白等因素有关[37]。

安全与否是菌株能否应用的基础，菌株安全性一般是通过体内或体外的方式考察，如鲁旭等[38]通过有毒代谢产物的测定及小鼠口服灌喂方式研究了粪肠球菌的安全性；蔡熙姮等[39]通过腹腔注射小鼠的方式证明蓝狐源嗜酸乳杆菌菌株是安全的。本研究使用本体动物鸡，以最高1.0×1011cfu/mL的活菌含量，采取口服灌喂的方式进行了动物安全性试验，结果表明，高、低剂量灌喂均未引起鸡只的死亡，各组雏鸡体质量及进食量与对照组无差异，剖检观察雏鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏均无肉眼可见病变。综上，植物乳杆菌BLCC2-0410对雏鸡无明显致病性，可作为禽用益生菌开发的储备资源。

遗传物质在复制过程中出现差错的频率为百万分之一，绝大多数的突变对菌株生命活动影响不大，但在发酵过程中，菌种的连续传代可能会导致菌株负变个体的不断积累，达到一定数量时，造成菌种生产性状、培养特性等的变化，退化现象会逐渐显现[40]。本研究中，植物乳杆菌BLCC2-0410传代5代、15代、25代的发酵性能、产酸能力、抑菌性能均无较大差异，说明植物乳杆菌BLCC2-0410传代25代以内稳定性良好。为保证菌株质量，可控制菌株传代次数在15代以内进行发酵生产。

综上，本研究筛选了1株对鸡白痢沙门氏菌具有良好抑制作用的植物乳杆菌，并对其生物学特性进行了较为详细的研究，有很大的开发潜力，有望在动物疾病防控中发挥重要作用。