应用溴甲酚紫建立贵州省辣椒炭疽病菌快速选药技术研究

刘阿丽，吴小毛,3，李荣玉,3，韩 磊，刘旭东，罗 跃

(1.贵州大学 作物保护研究所,贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 农学院,贵州 贵阳 550025； 3.贵州省山地农业病虫害重点实验室,贵州 贵阳 550025)

辣椒炭疽病是由半知菌亚门刺盘孢属不同种引起的全球性真菌性病害[1-2]。辣椒炭疽病与辣椒疫病、辣椒病毒病被称为辣椒上的三大病害。2016年，贵州辣椒炭疽病大面积暴发，严重影响了辣椒的品质和产量[3]。随着人民绿色环保意识的增强，转基因作物和生物防治已成为当今植物保护领域的热点，但化学药物防治仍是防治植物病害的主要手段。近年来，化学农药也凸显出诸多弊端，如农药残留、有害生物再度猖獗、生物抗药性、环境污染等问题。

咪鲜胺是一种广谱杀菌剂，属于麦角甾醇生物合成抑制剂，具有保护和铲除作用，对多种作物子囊菌和半知菌病害有显著防效[4]。而甲基硫菌灵是一种高效、广谱、内吸性杀菌剂，具保护和治疗作用，主要通过干扰致病菌有丝分裂中纺锤体的形成，使病菌孢子萌发长出的芽管扭曲异常，从而使病菌不能正常生长而达到杀菌效果。韦继彦等[5]研究表明，75%异菌·多·锰锌可湿性粉剂、32.5%苯甲·嘧菌酯悬浮剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂、75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒剂对于朝天椒叶片和果实上的炭疽病防效均较高；霍建飞等[6]明确咪鲜胺、咯菌腈、多菌灵和吡唑醚菌酯对尖孢炭疽菌菌丝抑制效果较好；莫佳强等[7]研究发现，25%咪鲜胺乳油500倍液对广西忻城辣椒炭疽病的防治效果达87.38%。化学农药的不合理使用容易导致病原菌产生抗药性，如咪鲜胺因长期大量使用已使部分地区稻瘟病菌产生抗药性[4]。

溴甲酚紫的分子式为C21H16Br2O5S，中文别名为二溴邻甲酚磺呋酞，可作为酸碱指示剂、吸附指示剂、氨基酸色谱法内标，还可用于银盐法滴定硫氰酸盐、分光光度法沉淀血清蛋白等。宁伟杰等[8]认为，溴甲酚紫肉眼识别的pH值变色范围为5.2(黄色)～6.8 (紫色)，反应化学式为： HIn⟺ H++In-(可逆反应)；其中，HIn与In-在溶液中表现出2种颜色,HIn在溶液中呈现出黄色，In-在溶液中呈现出紫色。任会萍等[9]以溴甲酚紫为发色剂，以含羟基的芳香族化合物为显色剂，制备了有机可逆热变色材料。傅成武等[10]以溴甲酚紫为发色剂，制得镧系复配物可逆热致变色材料；其变色机制为溴甲酚紫的内酯环结构与醌式结构之间的相互转变,即分子间的电子得失。袁玉华等[11]在ELISA丙肝测定试剂盒样品稀释液中加入酸碱指示剂溴甲酚紫，作为样品加注与否的指示，并进行对比试验，取得了较好的效果。王菊丛等[12]发现，在食品安全国家标准《食品微生物学检验大肠菌群计数》(GB 4789.3—2010)执行中，加入适量的溴甲酚紫指示剂,使结果观察更直观清楚。胡云峰等[13]运用溴甲酚紫pH指示剂来检测猪肉的新鲜程度，发现猪肉腐的程度与pH指示纸的颜色变化一致。何华鹏等[14]发现，溴甲酚紫指示剂制备的智能标签均能较好地识别不同质量青鱼的新鲜度。

目前，溴甲酚紫成功应用到医学、食品安全方面，也逐渐应用到病虫害的检测中，但采用溴甲酚紫检测辣椒炭疽病菌对咪鲜胺和甲基硫菌灵的敏感性和抗药性的研究尚未见报道，辣椒炭疽病菌对咪鲜胺和甲基硫菌灵的敏感基线也未见报道。因此，以敏感基线为基准，应用溴甲酚紫研制一种可以根据颜色变化来快速检测防治药剂对辣椒炭疽病菌是否有效的试剂盒，以解决田间施药时选药不准的问题。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试分离物 炭疽病标样于2018年7—9月采自贵州省辣椒主产区，其中，花溪21株、遵义30株、黔东南29株、毕节20株，共计100株，并采用组织分离法获得所需菌株，将分离、纯化后的菌株进行编号，鉴定后保存备用。显色反应以尖孢炭疽菌为供试菌种。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂17～20 g、蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 供试药剂 95%甲基硫菌灵(安徽广信农化股份有限公司)、97%咪鲜胺(武汉远成共创科技有限公司)、溴甲酚紫(德州润昕实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵和咪鲜胺的敏感性测定 采用菌丝生长速率法[15]测定辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵和咪鲜胺的敏感性。将甲基硫菌灵和咪鲜胺配制成5个质量浓度梯度的含药平板，分别为0.25、0.45、0.90、1.80、3.60 μg/mL和 0.023、0.045、0.090、0.180、0.360 μg/mL，以无菌水为对照。将菌饼接种于含药PDA平板中央，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5～7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，并运用DPS 13.0数据处理系统，计算各药剂对辣椒炭疽病菌菌丝生长抑制的回归方程、抑制中质量浓度(EC50值)、相关系数和95%置信区间，根据所得EC50值制作敏感性频率分布图，建立其敏感基线。

1.2.2 辣椒炭疽病菌快速选药技术的建立 采用菌丝生长速率法[15]。以敏感基线为基准，设置甲基硫菌灵和咪鲜胺质量浓度分别为0.06、0.12、0.23、0.45、0.90、1.80 μg/mL和 0.011、0.022、0.044、0.088、0.175、0.350 μg/mL，加入30 μL 2%溴甲酚紫指示剂与药剂均匀混合后，加入到含PDA灭菌培养基的锥形瓶中再次混匀，然后倒入直径为9 cm的灭菌培养皿中，将菌饼接种于PDA平板中央。设含病原菌和指示剂的平板培养基为CK，只含指示剂的平板培养基作空白对照，每个处理3次重复，于28 ℃恒温培养。其中，药剂+显色剂(溴甲酚紫)混合后为黄色，药剂+指示剂+培养基混合后为浅绿色。分别在接种30 min、24 h、48 h、72 h后观察辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵和咪鲜胺的显色反应与时间的变化关系。

2 结果与分析

2.1 辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性分析

由表1可知，不同地区辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性存在一定差异。该药剂对辣椒炭疽病菌菌株的EC50最小值为0.388 4 μg/mL，最大值为1.019 6 μg/mL，EC50均值为0.764 1 μg/mL。较敏感菌株的EC50值为不敏感菌株的EC50值2.63倍。遵义地区辣椒炭疽病菌菌株对甲基硫菌灵药剂较为敏感，其EC50平均值为0.641 7 μg/mL；其次是花溪地区和黔东南地区，EC50均值分别为0.824 7 μg/mL和0.722 2 μg/mL；毕节地区的辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性较差，其EC50平均值为0.867 6 μg/mL。

表1 不同地区辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性

贵州省4个地区的100株辣椒炭疽病菌菌株对甲基硫菌灵的敏感性呈连续分布(图1a)所示。以100个供试菌株的EC50值为依据，辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的EC50值介于0.388 4～1.019 6 μg/mL；以0.09 μg/mL为截距，分成7个区间，计算每个区间的菌株频率。以EC50中值为横坐标，频率为纵坐标， 绘制EC50的频率分布图(图1b)。由图1b可知，EC50值在0.57～0.93 μg/mL呈近似正态分布，有连续的单峰曲线，可将此曲线的EC50平均值(0.764 1±0.150 8) μg/mL作为辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感基线。

图1 辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感性分布(a)及敏感性分布频率(b)

2.2 辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵快速选药技术分析

由图2可知，甲基硫菌灵质量浓度为0.23 μg/mL时，接菌30 min后显淡紫色，但效果不明显，其他质量浓度无颜色变化；24 h后已经出现显色变化，48 h后显色效果明显，甲基硫菌灵质量浓度为0.23 μg/mL显紫色，0.45～0.90 μg/mL显示橙色，质量浓度为1.80 μg/mL时显示淡黄色。72 h后可以作为显色的判断依据，加快了检测速度。

a—d分别表示接种后30 min、24 h、48 h和72 h

当用溴甲酚紫作为指示剂时，尖孢炭疽菌在PDA培养基的生长呈现出明显的颜色变化如表2所示，甲基硫菌灵质量浓度在0～0.23 μg/mL时显示均为紫色，随着甲基硫菌灵质量浓度的上升，颜色逐渐变淡，药剂质量浓度在0.45～0.90 μg/mL时显示出橙红色，药剂质量浓度在1.80 μg/mL时呈现出浅黄色。

表2 不同质量浓度甲基硫菌灵下溴甲酚紫显色剂的颜色变化

2.3 辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性分析

由表3可知，不同地区辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性存在一定的差异，EC50最小值为0.041 8 μg/mL，最大值为0.102 4 μg/mL，EC50平均值为0.071 0 μg/mL。较敏感菌株的EC50值为不敏感菌株的EC50值2.45倍。毕节地区的辣椒炭疽病菌对咪鲜胺较敏感，其EC50平均值为0.066 0 μg/mL；其次是花溪地区和黔东南地区，EC50平均值均是0.068 4 μg/mL；而遵义地区的辣椒炭疽病菌对咪鲜胺敏感性最差，其EC50平均值为0.081 0 μg/mL。

贵州省4个地区的100株辣椒炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性呈连续分布(图3a)。分析100个供试菌株的EC50值，辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的EC50值介于0.041 8～0.102 4 μg/mL，以0.009 μg/mL为截距，将其分成7个区间，并计算出每个区间出现的菌株频率。以区间EC50中值为横坐标，频率为纵坐标，以此数据绘制EC50的频率分布图(图3b)。由图3b可知，EC50值在0.059～0.95 μg/mL呈近似正态分布，故以EC50平均值(0.071 0±0.013 3) μg/mL作为辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感基线。

表3 不同地区辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性

图3 辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性分布(a)及敏感性分布频率(b)

2.4 辣椒炭疽病菌对咪鲜胺快速选药技术分析

根据图4发现，咪鲜胺质量浓度在0.022 μg/mL时接菌30 min后显淡紫色，但显色效果不明显，其他质量浓度无颜色变化，24 h后已出现显色变化，48 h后显色效果明显，咪鲜胺质量浓度为0.044 μg/mL显紫色，0.088～0.175 μg/mL时显示橙色，0.350 μg/mL时显示淡黄色，72 h后可以作为显色的判断依据。

a—d分别表示接种后30 min、24 h、48 h和72 h

当用溴甲酚紫作为指示剂时，尖孢炭疽菌在PDA培养基上生长时呈现出明显的颜色变化如表4所示，在药剂质量浓度为0～0.044 μg/mL时颜色均为紫色，颜色随着药剂质量浓度的增加逐渐变淡，药剂质量浓度为0.088～0.175 μg/mL时颜色变成了橙红色和橙黄色，质量浓度为0.350 μg/mL时则变成了黄色。

表4 不同质量浓度咪鲜胺下溴甲酚紫显色剂的颜色变化

2.5 试剂盒的组成

研制出辣椒炭疽病菌2种快速选药试剂盒，其中一是由2%溴甲酚紫溶液、0.45 μg/mL或0.90 μg/mL或1.80 μg/mL甲基硫菌灵及PDA培养基组成的试剂盒。病原菌在0.45 μg/mL甲基硫菌灵的试剂盒上显示橙红色，则表明比较敏感；在0.90 μg/mL甲基硫菌灵的试剂盒上显示橙黄色，表明还可以作为辣椒炭疽病菌的防治药剂；在1.80 μg/mL甲基硫菌灵的试剂盒上显示黄色则表明已经产生抗性。二是由2%溴甲酚紫溶液、0.088 μg/mL或0.175 μg/mL或0.350 μg/mL咪鲜胺及PDA培养基组成的试剂盒。在0.088 μg/mL咪鲜胺的试剂盒上显示橙红色则表明比较敏感；在0.175 μg/mL咪鲜胺的试剂盒上显示橙黄色时，表明还可以作为辣椒炭疽病菌的防治药剂；在0.350 μg/mL咪鲜胺的试剂盒上显示黄色则表明已经产生抗性。

3 结论与讨论

本研究通过对贵州省4个辣椒主产区100株辣椒炭疽病菌敏感性测定，建立了贵州省辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感基线为(0.071 0 ± 0.013 3)μg/mL，与杨石有等[16]研究结果中116株芒果炭疽病菌菌株对咪鲜胺的敏感性(其EC50均值为0.012 4 μg/mL)存在差异。本研究通过对贵州省4个地区100株辣椒炭疽病菌的敏感性进行测定，建立了贵州省炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感基线为(0.764 1±0.150 8) μg/mL，这与董丁铭[17]建立的荔枝炭疽病菌对甲基硫菌灵的敏感基线[(0.643 3±0.215 6) μg/mL]存在一定的差异。贵州省辣椒炭疽病菌对咪鲜胺和甲基硫菌灵的敏感性与其他研究存在差异，可能是由于不同地区、不同作物、不同病原菌所致。本研究发现，贵州省4个地区辣椒炭疽病菌对咪鲜胺和甲基硫菌灵仍处于敏感水平，建议与其他类型杀菌剂交替使用以延长该类药剂的使用寿命。

以敏感基线为基准，应用溴甲酚紫指示剂检测辣椒炭疽病菌对甲基硫菌灵和咪鲜胺的敏感性显色反应，当用溴甲酚紫作为指示剂时，pH值变色范围为5.2(黄色)～6.8(紫色)，颜色变化比较明显，检测液的初始颜色呈紫色,反应终点颜色变成黄色，区分度明显[18]。酸碱指示剂溴甲酚紫的显色度与酸量成正比，如郭真香等[19]研究发现，稻瘟病菌在生长过程中产生的酸使培养基的pH值下降，加入防治药剂后，有抑制和杀菌的作用。本研究研制的试剂盒中，田间病原菌在0.350 μg/mL咪鲜胺试剂盒上显示黄色则表明已经产生抗性，在0.088 μg/mL咪鲜胺试剂盒上显示橙红色则表明比较敏感；在1.80 μg/mL甲基硫菌灵试剂盒上显示黄色则表明已经产生抗性，在0.45 μg/mL甲基硫菌灵试剂盒上显示橙红色则表明比较敏感。高晓月等[20]研究发现，溴甲酚紫指示剂添加量为20 mg/L、pH值为7.2时,检测液显色效果较好，此检测方法可在3～4 h使指示剂变色(紫色～黄色)，易用肉眼区分，建立了对畜禽肉中抗生素进行联合初筛的高通量方法。在本试验中，试剂盒的检测时间可以从7～10 d缩短为3 d，提高了甲基硫菌灵和咪鲜胺对辣椒炭疽病菌的检测速度。目前，甲基硫菌灵和咪鲜胺对贵州省辣椒炭疽病菌依然有防治效果，但建议与其他药剂进行复配以提高药效，延缓抗药性的产生。本研究研制成的试剂盒可用于快速检测辣椒炭疽菌对防治药剂甲基硫菌灵和咪鲜胺的敏感度，可以指导农民适时、适量科学用药，对农业生产、社会与环境具有重要意义。