仁化县贡柑主要病害的调查与检测

（广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】贡柑Citrus reticulata blancovar.Gonggan（Deqing tribute orange）又称“皇帝柑”或“贵妃橙”，有“中国柑王”之称，它集中了橙类外形美和柑桔肉质细嫩、易剥皮的双重优点，是南方优系柑橘地方品种，口感极佳，特别适合鲜食［1-2］。广东省韶关市仁化县位于南岭山脉南麓，广东省北部，粤、湘、赣三省交界地，属于中亚热带南区，气候温和，雨量充沛，环境优良，适合种植贡柑。同时仁化县贡柑主产区的土壤为丹霞地貌冲积形成的红砂岩壤土，有机质含量较丰富，非常有利于发展贡柑产业［3］。目前，仁化县已成为广东省最大的贡柑产业基地［4］。据《广东统计年鉴》报道，2003 年仁化县柑橘类种植面积仅12942 hm2，年产量10.27 万t；以后逐年增加，2018 年仅贡柑种植面积就达到约13333 hm2，总产量达35 万t，总产值14.5 亿元，占全县农业总产值的48.2%，已经成为农民增收致富的重要支柱产业。【前人研究进展】柑橘黄龙病是世界性难防难治病害之一，目前还没有抗性柑橘品种被发现和报道［5］。我国柑橘黄龙病菌主要由柑橘韧皮部细菌属亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）引起，目前还不能被人工培养［6-7］。柑橘病毒病为柑橘生产上普遍发生的病害，能够极大地减弱树势、减少产量和减低果品品质。据报道，我国目前主要有4 种常见的柑橘病毒病，分别为柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘碎叶病和柑橘黄脉病［8-10］。柑橘炭疽病和柑橘褐斑病是柑橘生产上重要的真菌病害，在我国，柑橘褐斑病报道于2007 年的重庆万州红橘上，主要为害柑橘叶片、果实和新梢；幼叶受害先出现褐色针头状大小的病斑，周围有黄色晕圈；新梢发病时形成褐色不定形凹陷的褐色或黑色小点,而后继续扩大，最后病斑以上新梢会变褐枯死；发病严重时会造成落叶落果，甚至枝梢枯死［11］；柑橘炭疽病可在柑橘叶片、枝梢、花、果上发生，同样可引起落叶、枯梢、落果及储藏期果实病害，对柑橘树势和产量、效益影响都很大［12］。但是关于仁化县贡柑主要病害的调查和分析还未见详细报道。【本研究切入点】为全面了解仁化县贡柑果园病害发生情况，于2019 年4－10 月前往仁化县3 个镇（街道）4 个有代表性的贡柑果园进行柑橘病害的普查和分析。【拟解决的关键问题】通过调查研究，弄清楚仁化县贡柑上的主要病害，以期为该地区柑橘病害的有效防治和柑橘产业的健康发展提供理论依据和指导价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试样品采集于2019年4月贡柑谢花挂果期和10月果实成熟期。主要调查仁化县3个镇（街道）4个贡柑果园，其基本情况见表1。调研时所采集的样品（株）为果园的不同方位随机采集，每个样品为同一株树不同方向上的若干枝条各采1～3个叶片或果实，优先采集枝条上具有黄化症状的叶片或果实。

表1 调查的4 个果园基本情况Table 1 Basic information of the four investigated orchards

1.2 试验方法

1.2.1 植物DNA和RNA的提取、检测及RNA的反转录 植物DNA和RNA的提取：每份DNA和RNA样品均采集3～7个柑橘叶片的中脉或柑橘果实的果皮，用刀片切碎，而后用液氮快速将样品磨碎，依次类推。每个样品单独用一副手套、一个研钵和研磨棒（使用前需对研钵和研磨棒进行高温灭菌处理）。DNA的提取严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒为（AXYGEN）爱思进动植物基因组DNA制备试剂盒，具体提取方法见试剂盒说明书（Axygen Scientific Inc，美国）；RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒（货号DP441，RNAprep Pure Plant Plus Kit），具体操作见试剂盒说明书（北京天根生化科技有限公司）。

DNA 和RNA 的检测：取2 μL 样品在超微量紫外/可见分光光度计（Nano-100）仪器上进行检测，读取并记录DNA 和RNA 的含量和质量数值。

RNA的反转录：具体操作见天根生化科技有限公司反转录试剂盒说明书〔货号KR116 -02，FastKing RT Kit（with gDNAase）〕。

1.2.2 柑橘黄龙病的检测 本研究采用实时荧光定量PCR（Quantitative PCR）的方法对贡柑叶片及果实中的黄龙病菌进行检测。所有的检测实验均在ABI PRISM 7500（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）上进行。同时以柑橘黄龙病亚洲种的部分16S rDNA 序列为模板设计引物,引物的设计主要参照Li 等的方法：HLBas：5-TCGAGCGCGTATGCAA TACG-3，HLBr：5-GCGTTATCCC GTAGAAAAAGGTAG-3，利用探 针HLBp:5-6-carboxy -fluorescein（FAM）-AGACGGGTGA GTA ACGCG -Black Hole Quencher（BHQ）-1-3 对样品进行检测［13］。所用试剂为购自TAKARA 公司的Premix Ex Taq（Probe qPCR），所用引物和探针均合成于上海生工生物工程股份有限公司。实时荧光定量PCR 操作的具体体系（25 μL）为：12 μL Premix Ex Taq（Probe qPCR），0.5 μL HLBas/HLBr，1 μL HLBp，1μL DNA（50 ng/μL），10 μL ddw。具体程序为：95 ℃/30 s,40 个循环95 ℃/5 s～60 ℃/30 s。程序运行结束后，读取Ct value 数值，以备后续分析。本团队利用标准品做出来的Ct value 与菌含量的关系为：Y=-0.286X+11.924，其中X为Ct value 值，Y为拷贝数，每克植物组织中含有的病原菌拷贝数为10Y［14-15］。

1.2.3 柑橘病毒病的检测 为了对仁化县贡柑果园内的主要柑橘病毒病进行分析，本研究根据已报道的参考文献中的检测引物，重点对柑橘衰退病、裂皮病、碎叶病和黄脉病进行检测。提取样品的RNA并以其反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，具体体系（20 μL）为:10 μL Premix Ex Taq，0.5 μL F/R，1μL cDNA（50 ng/μL），8 μL ddw；具体程序如下：95 ℃/5 min，35个循环94 ℃/30 s、54 ℃/30 s、72 ℃/1 min，然后72 ℃/5 min，16 ℃/forever。PCR结束后进行电泳，并对结果进行总结和分析。

1.2.4 病原菌的分离、致病性测定和分子生物学鉴定 病原菌的分离：由于在田间调查的过程中发现，每个果园都存在有不同程度的叶尖或叶缘褐变、叶枯和枝枯等现象。因此，我们在每个果园中选取3～4个枝条进行病原菌的分离，具体操作如下：选取发病的柑橘叶片和茎杆，用解剖刀在病健交界处取出0.2 mm2左右的小块，依次在70%酒精中30 s、2%NaClO 2～3 min、无菌水冲洗3～5次，置于无菌滤纸上在超净台中晾干，最后放置于PDA培养基上25 ℃进行培养。培养3 d后，分离物上长出白色菌丝；培养7 d后，在显微镜下对分离所得菌株的菌丝和孢子进行镜检。

致病性测定：采用针刺和菌丝块相结合的接种方法，分别在健康柑橘叶片上进行致病性测定；菌丝块未针刺接种和空白PDA培养基接种作为阴性对照。

分子生物学测定：将单孢子培养7 d 的菌落从PDA 平板上刮下来，迅速用液氮研磨。而后依据Axygen 动植物基因组DNA 制备试剂盒的说明书进行DNA 的提取。选取核糖体转录间隔区（ITS）［ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'–TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'］为检测引物，已提取的gDNA 为模板进行PCR扩增［16］。反应体系为:94℃ 3 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 30 s,36 个循环；72℃ 5 min 延伸。然后对得到的PCR 产物进行电泳检测，将获得的阳性PCR 产物进行测序。测序后的序列在NCBI上进行BLAST。

2 结果与分析

2.1 仁化县柑橘黄龙病检测结果

为了详细了解仁化县贡柑上柑橘黄龙病的发病情况，采用实时荧光定量PCR 检测方法对采集自仁化县不同果园共计150 个样品进行贡柑黄龙病的检测。结果（表2）发现，2019 年4 月4 个贡柑果园黄龙病检出率为13.2%（6.7%～18.2%），2019 年10 月检出率为31%（14.3%～87.5%）。而2019 年4 月份QRCR 检测的Ct 值范围为279.3～0，10 月份为6.09～0。具体表现为：采自丹霞街葛布村的阳性检出率最低，黄坑镇黄坑村的阳性检出率最高。除来自黄坑镇下营村的样品黄龙病阳性抽检率从4 月份的16.7%下降到10月份的14.3%外，其他果园4 月份的阳性抽检率均低于10 月份的阳性抽检率。值得注意的是，来自黄坑镇黄坑村的失管果园，柑橘黄龙病的阳性检出率就从2019 年4 月的18.2%上升到10 月的87.5%；丹霞街葛布村果园的阳性检出率则从6.7%上升到14.3%。

2.2 仁化县4 种主要柑橘病毒病的检测结果

柑橘病毒病是柑橘生产上重要的病害之一，为了分析仁化县贡柑上柑橘病毒病的为害情况，选用已报道的4种主要柑橘病毒病的相关检测引物为引物，采集的150个样品的cDNA为模板进行分析。结果（表3）表明，2019年4月在仁化县4个贡柑果园均能够检测到衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV），检出率为41.18%（33.33%～54.55%）；而裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）仅在丹霞街葛布村1个样品中检测到，检出率为6.67%，其他果园均未检测到；碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）在4个贡柑果园中均没有被检测到。而在2019年10月的检测中，4个果园均能够检测到柑橘衰退病毒病，检出率为100%，其他3种病毒病在4个果园中均没有检测到。结果说明仁化县的柑橘衰退病有一定程度的为害，而其他被检病毒病则发生较低或没有发生。

表2 仁化县贡柑黄龙病检测结果Table 2 Detection results of citrus Huanglongbing in Renhua County

表3 仁化县贡柑病毒病检测结果Table 3 Detection results of citrus virus diseases in Renhua County

2.3 其他主要真菌病害的调查和检测

图1 柑橘褐斑病和炭疽病复合侵染的田间症状和病原菌生物性状Fig.1 Field symptoms and pathogenic biological characters under compound infection of citrus brown spot disease and citrus anthracnose

2019年4月和10月田间病害调查发现，4个果园中的柑橘植株均存在不同程度的叶尖或叶缘褐变，有的叶片上有褐色斑点，病斑不规则形；腋芽处发现淡褐色病斑，引起枯叶和枯枝的情况，病梢枯死，花穗变褐，引起落花，见图1A。经病原菌分离，共分离到2种不同的真菌，见图1B、D；2种真菌在PDA上最开始都长出白色菌丝，3～5 d后，真菌B的菌落呈现出灰色，并伴有大小不一的橙色孢子堆出现在上面；真菌D的菌落则完全变为灰黑色。在电子显微镜下观察发现，真菌B的菌丝有分割和分叉，分生孢子卵圆形，且有明显的油珠；真菌D的菌丝有分隔和分叉；分生孢子有喙和多个纵、横隔膜。通过真菌通用引物ITS对真菌B和真菌D进行分子生物学鉴定发现，真菌B为炭疽属真菌（Colletotrichumsp.），真菌D为链格孢属真菌（Alternariasp.）（图1B～G）。菌丝块在健康柑橘（贡柑）叶片上回接试验5 d后，分离所得的炭疽属真菌和链格孢真菌能够分别在健康柑橘上引起柑橘炭疽病和柑橘褐斑病的典型症状；但经过20 d后这2种真菌分别引起的症状与田间症状相似。这与过去的相关报道相一致：炭疽属真菌主要引起柑橘炭疽病，链格孢属真菌则引起柑橘褐斑病；而褐斑病和炭疽病在柑橘上的发病后期在症状上更多表现为混合感染、很难分辨。

3 讨论

通过2019年4月和10月对仁化县柑橘黄龙病的调查发现，除来自黄坑镇下营村的样品黄龙病阳性抽检率4月份与10月份的几乎相当外，其他果园的柑橘黄龙病阳性抽检率4月份均低于10月份；尤其是黄坑镇黄坑村的阳性抽检率从18.2%上升为87.5%。造成这种巨大差异的原因，首先与采样时期、病树清理和栽培管理相关，有研究报道柑橘木虱的峰期集中在6月下旬至7月下旬、8月中旬至9月中旬、10月上旬至11月上旬，而木虱的大流行会加重柑橘黄龙病的发生［17-19］；其次是采样造成的，由于单个柑橘植株上黄龙病菌的分布并不均匀［20］，尤其是黄坑镇黄坑村的失管园已经毁园2年左右，2019年4月树上仍有绿叶，而10月份全园果树均呈现出衰败的景象，叶片大部分黄化，果实极少。同时本研究在对该地区柑橘衰退病毒病进行检测时也发现10月份其阳性检测率达到100%，远高于4月份的现象，这主要是由于采样的优先选择造成的，但是也从侧面说明该地区的柑橘衰退病有一定程度的发生。

同时，由于采样时优先选择了黄化症状的样品，则该地区柑橘黄龙病的实际发病率应低于20%，且含菌量较低，因此可以采取分类防控的技术措施进行综合防控：加强以田间管理为重点的优质高产可持续发展的综合防治措施，以农业防治为基础，增施有机肥，实行配方平衡施肥，增施钾肥，避免过量氮肥，改善土壤理化性状，创造根系生长的良好环境。及时做好果园排灌工作，降低水田果园的水位，以增强树势，提高贡柑抗病力为关键，同时加强田间病情测和评估，及时喷药防治，减少病原基数。具体措施如下：（1）对黄坑镇黄坑村等处于失管状态或每667 m2产量低于750 kg 或株产低于10 kg 的老旧或生长衰弱的贡柑园，彻底挖除病树并火烧处理被挖树体，进行彻底清园，重新进行整体规划，重新种植无病贡柑种苗或改种其他植物；（2）对于丹霞街葛布村贡柑园、石塘镇贡柑园、黄坑镇下营村等贡柑园，应加强栽培管理，保持树势健壮，提高耐病能力，及时挖除病树，挖树前最好能对病树及周围贡柑树喷施一次杀虫药剂，并火烧处理被挖树体，并可在果园空缺的地方补种无病柑橘大苗;（3）需加强对贡柑种苗的检测检疫，培育种植无病苗木，保护新发展的种植区；尤其是加强对柑橘衰退病毒病的抽检；（4）在生长期定期统一喷药，统防统治黄龙病田间传播媒介—柑桔木虱，重点减少成虫产卵，杀死卵块和低龄若虫，遏制黄龙病传播蔓延、减少黄龙病疫情危害。可在每轮新梢抽发2～3 cm 长及将转绿时及时喷药防治（即1 梢2 药，间隔7～10 d）。药剂可选用10%吡虫啉乳油 2000～3000 倍液、3%啶虫脒乳油 1000～1500 倍液、40%毒死蜱乳油1000～1500 倍液、25%噻虫嗪水分散粒剂2500～3000 倍液、2.5%溴氰菊酯乳油2000～3000 倍液、8.8%阿维·啶虫脒乳油 2000～4000 倍液、2.5%高效氯氰菊酯乳油 1000～1500 倍液、2.5%阿维·吡虫啉乳油 2000～3000 倍液、2.5%鱼藤酮乳油300～500 倍液、25%灭幼脲悬浮剂1000～2000倍液等［21-22］。

在对该地区其他病害进行调查和研究时发现，部分果园的零星柑橘叶片两面突起，组织木栓化，中央凹陷破裂呈灰褐色火山口状，且病斑版周围有黄色晕圈，初步鉴定为柑橘溃疡病，这可能与2019 年该地区多雨高温的气候相关［23-24］。同时发现，柑橘炭疽病和柑橘褐斑病在果园中的部分发病症状相似并难以分辨，后期症状几乎一致；引起溃疡病的Colletotrichumsp.和引起褐斑病的Alternariasp.，有的在病样上被单一分离到，有的在病样上同时被分离到。在对柑橘溃疡病和柑橘褐斑病进行化学防治时，所选用的药剂也不同。如防治柑橘炭疽病的二氰·吡唑酯、苯甲·锰锌、硅唑·多菌灵、吡唑醚菌酯、苯甲·吡唑酯、咪鲜胺、氟硅唑、唑醚·代森联、唑醚·甲硫灵、氟环唑、咪鲜胺锰盐、唑醚·戊唑醇、嘧菌酯、氟啶胺、肟菌·戊唑醇、代森锰锌等；目前在生产上还没有防治柑橘褐斑病的登记杀菌剂，但可选用已登记防治柑橘炭疽病的杀菌剂进行兼治［25-26］；已登记防治柑橘溃疡病的杀菌剂有王铜、氢氧化铜、喹啉铜、春雷喹啉铜、碱式硫酸铜、硫酸铜钙、春雷王铜、枯草芽孢杆菌、中生乙酸铜、噻唑锌、波尔多液、松酯酸铜、氧化亚铜、噻森铜、络氨铜等［27］。因此我们建议仁化县在进行柑橘病害防治时，选用同时防治多种病害的复合药剂进行防控，不仅可增加对田间病害的有效防治，同时可延缓田间病害的抗药性。

4 结论

仁化县目前的主要柑橘品种为贡柑，且种植面积逐年扩大。通过对该地区失管果园柑橘黄龙病抽检阳性率从18.2%上升到87.5%可以看出，在果园种植过程中及时挖除病树和加强果树栽培管理的重要性。同时该地区其他3个果园的柑橘黄龙病发病率应低于20%，因此，可通过加强以田间管理为重点的优质高产可持续发展的分类防控等综合防治措施加强防控，尽量减轻黄龙病对柑橘产业的危害，延长柑橘园的丰产年限和生产寿命。同时该地区主要的柑橘病毒病衰退病毒病的发病率较高，从4月份的平均阳性抽检率41.18%上升到10月份的100%，虽然有采样的偏向性的原因，但也说明该地区柑橘衰退病有一定程度的发生；建议在种苗生产或种植前加强对贡柑衰退病毒病的检测，在生产中加强防治。在对柑橘炭疽病进行防治的同时，要加强柑橘褐斑病等真菌病害及柑橘溃疡病等细菌病害的防治，合理用药，减少化学农药用量。