结直肠癌组织中NEK2的表达及其对HCT116细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

崔发财，陈瑜，胡敏，毋小玉，魏晓霞

0 引言

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，在我国患病率和死亡率分别居于第三位和第五位[1]，尽管近年来在诊断和治疗技术上取得了较好的进展，但进展期结直肠癌尤其伴发远端转移的患者预后仍然较差[2]。中心体相关激酶2（NIMA-related kinase 2,NEK2）是一种周期性表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控多种细胞周期相关蛋白活性，也是中心体的重要组成部分，对维持有丝分裂进展和双极纺锤体的正确形成发挥重要的调控作用，它还与细胞中心体上的微管相结合促进G2/M期细胞中心体分离。研究发现NEK2异常活化将导致中心体的复制失败和不成熟的中心粒分离，出现染色体不稳定和非整倍体，从而参与了癌症的起始过程。目前已经在胃癌[3]、小细胞肺癌[4]、前列腺癌[5]等多种肿瘤中发现NEK2表达上调并促进肿瘤细胞增殖及侵袭，然而NEK2的表达水平与结直肠癌的关系目前还鲜有报道，本研究旨在探明NEK2在结直肠癌组织中的表达水平及其与临床病理特征的关系，研究沉默NEK2对结直肠癌细胞HCT116增殖及侵袭迁移能力的影响及可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 收集2016年1月—12月在河南省人民医院行结直肠癌根治术的100例患者的癌组织及癌旁组织（距癌灶边缘>5 cm取材），其中男68例、女32例，中位年龄59岁（24～76岁）。所有患者术前均未接受放化疗，术后病理结果均经2名以上病理医师确认，且都有完整的临床病例资料，本研究遵循医学伦理学要求。

1.1.2 细胞株及主要试剂 人结直肠癌细胞株HCT116、SW480、SW620和人正常结直肠黏膜细胞FHC均保存于河南省人民医院中心实验室。胎牛血清（FBS）、RPMI1640培养基、胰蛋白酶及流式细胞术单染试剂碘化丙锭（PI）购自美国Gibco公司；RNA提取液、qRT-PCR试剂盒及反转录试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成；免疫组织化学试剂盒及DAB显色液、兔抗人多克隆抗体NEK2（PAH562）、E-cadherin（PAB290）、N-cadherin（PAE582）、CDK4（PAC045）及兔抗人单克隆抗体cyclin D1（PAB021）均购自武汉云克隆科技股份有限公司；CCK8试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司；Transwell小室（孔径3.0 μm）购自美国Corning公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学染色法检测结直肠癌组织中NEK2表达 结直肠癌组织石蜡块以4 μm连续切片，S-ABC法染色；二甲苯脱蜡，乙醇水化后行抗原修复，4%H2O2阻断10 min，5%BSA于37℃封闭1 h，滴加兔抗人多克隆抗体（1:100）4℃过夜。生物素化二抗（1:500）孵育1 h后加入新鲜配置的DAB液显色，苏木精对比染色后树胶封片，观察染色情况。结果判定参照文献报道[6]，采用5点评分系统评价阳性细胞数：无阳性细胞数为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分；采用4点评分系统评价细胞染色强度：无染色（-）为0分，染色弱为（+）为1分，染色呈棕黄色（++）为2分，呈深棕色（+++）为3分。两项计分的乘积为免疫反应性分数（immunoreactivity scores,IRSs），IRSs≤4为NEK2蛋白低表达，>4为NEK2蛋白高表达。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测NEK2基因在不同结直肠癌细胞系中的表达水平 以细胞生长融合度达80%～90%时收集细胞，根据TRIzol操作说明书提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒和荧光定量试剂盒操作说明书进行PCR定量反应。引物序列分别为：NEK2正义链为5'-TGCTTCGTGAACTGAAACATCC-3'，反义链为5'-CCAGAGTCAACTGAGTCATCACT-3'；GAPDH正义链为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反义链为5'-GGCTGTTGTCATAC TTCTCATGG-3'。PCR反应条件如下，反转录反应为42℃ 60 min，70℃ 10 min，冰上降温，PCR预变性95℃ 10 min，然后95℃ 15 s、60℃ 60 s、每20 s升温1℃，共40次循环。根据目的基因NEK2和内参基因GAPDH测得CT值差异，运用2-ΔΔCt（RQ）法计算NEK2的相对表达量，实验重复3次。

1.2.3 细胞分组与转染 取对数生长期的HCT116细胞，以2×105个/孔接种至6孔培养板，培养24 h。待细胞达到70%～80%融合时，按照LipofectamineTM2000脂质体试剂盒说明书转染细胞，实验细胞分为阳性转染组（si-NEK2）、阴性对照组（si-CTRL）和空白组。NEK2 siRNA干扰正义链：5'-GCUUGUUUCUGAAGUGAAUTT-3'；CTRL siRNA干扰正义链：5'-AAGTAGCCGAGCTTCGATTGC-3'，均由吉玛基因合成。

1.2.4 免疫印迹法检测敲低NEK2对HCT116细胞NEK2、E-cadherin、N-cadherin、CDK4及cyclin D1蛋白表达的影响 收集细胞并用细胞裂解液裂解提取细胞总蛋白，取50 μg蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，然后将蛋白转移到PVDF膜上，1%BSA封闭过夜，分别加入NEK2（1:500）、N-cadherin（1:500）、E-cadherin（1:500）、CDK4（1:200）、cyclin D1（1:400）及GAPDH（1:1 000）一抗37℃孵育2 h，TBST漂洗后，加入1:1 000稀释的羊抗兔二抗37℃孵育1 h，将PVDF膜浸于1 ml显色液中避光约10 min后观察结果，用凝胶图像处理系统分析目标条带的相对分子质量和净吸光度值。实验重复3次。

1.2.5 CCK8法检测敲低NEK2对HCT116细胞增殖能力的影响 将100 μl密度为每毫升5×104个细胞的悬液加入96孔板中，细胞贴壁后加入CCK8试剂，分别在24、48、72 h后应用酶标仪测定450 nm处的光密度（OD）值，代表细胞增殖水平。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞学检测敲低NEK2对HCT116细胞周期分布的影响 细胞按照每毫升5×105个接种于培养瓶中常规培养，细胞融合度达到80%时转染细胞并继续培养48 h，胰酶消化并收集细胞，2 500 r/min离心5 min取细胞沉淀，PBS洗涤两次，细胞经预冷的70%乙醇4℃固定18 h，离心弃固定液，PBS洗涤3次，调整细胞浓度为每毫升1×106，取1 ml细胞悬液，与含20 μg/ml RΝA酶的Tris-HCL缓冲液37oC孵育30 min，用50 μg/ml碘化丙锭（PI）进行细胞DNA染色。样品用Beckman counter公司FC500MCL/MPL流式细胞仪测细胞周期，采用Multicycle for windows数据分析系统进行数据分析，实验重复3次。

1.2.7 Transwell小室法检测敲低NEK2对HCT116细胞侵袭能力的影响 紫外线照射消毒8 μm膜孔Transwell板，下室加入含趋化因子的细胞培养液，各实验组细胞以5×104/ml接种于含人工基底膜成份的Transwell小室并套入下室，37℃培养箱孵育24 h。取出上室，吸取残液。在下室中添加70%甲醛固定30 min，常规结晶紫染色，在高倍镜视野下计数小室面细胞数即为穿透细胞数。

1.2.8 细胞划痕实验检测敲低NEK2对HCT116细胞迁移能力的影响 各实验组细胞胰酶消化后以5×105个/毫升接种于6孔板中，待细胞融合度达到100%时用10 µl移液器枪头在培养孔底部划痕，空白组作为对照，继续培养48 h后显微镜下观察细胞迁移距离并拍照，测量多个点划痕宽度，计算平均划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.3 统计学方法

SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数差异的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。采用秩和检验分析NEK2表达水平与临床病理特征的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NEK2蛋白在CRC组织中的表达及其与CRC临床病理特征的关系

免疫组织化学结果显示NEK2蛋白主要定位于肿瘤细胞胞质，少部分定位于胞核内，染色呈棕黄色和深黄色，而在癌旁组织中不表达或弱阳性表达于正常黏膜细胞胞质内，见图1；根据免疫组织化学评分标准，NEK2蛋白在癌组织中阳性表达率为65%（65/100），明显高于癌旁组织38%（38/100），差异有统计学意义（χ2=14.593,P<0.01）；结果发现NEK2表达与结直肠癌TNM分期、淋巴结转移和远处转移显著相关（均P<0.05），而与性别、年龄、肿瘤直径大小及肿瘤分化程度无显著相关（均P>0.05），见表 1。

2.2 NEK2 mRNA和蛋白在结直肠癌细胞中表达高于正常对照细胞

图1 NEK2蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达 (免疫组织化学 ×200)Figure 1 Expression of NEK2 protein in colorectal cancer and adjacent normal tissues (IHC ×200)

表1 NEK2表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系Table1 Relation between NEK2 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(CRC) patients

qRT-PCR结果显示NEK2 mRNA在结直肠癌细胞SW480、SW620和HCT116中的表达含量明显高于正常结直肠黏膜细胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116细胞表达含量最高，见图2A；Western blot结果显示，NEK2蛋白在结直肠癌细胞SW480（3.78±0.17）、SW620（2.62±0.36）和HCT116（4.35±0.18）中的表达含量明显高于正常结直肠黏膜细胞FHC（均P<0.01），以低分化HCT116细胞表达含量最高，见图2B。

2.3 NEK2 siRNA可显著降低HCT116细胞中NEK2 mRNA及蛋白表达量

si-NEK2及si-CTRL转染细胞后，阳性转染（si-NEK2 HCT116）组的NEK2 mRNA表达水平（0.28±0.07）显著低于阴性对照（si-CTRL HCT116）组（1.03±0.14）及空白（HCT116）组（均P<0.01），阳性干扰组NEK2蛋白相对表达含量（0.18±0.07）显著低于阴性对照组（1.03±0.14）及空白组（均P<0.01），见图3，阴性对照组与空白组间NEK2 mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 敲低NEK2后结直肠癌细胞增殖能力显著下降

CCK8检测结果显示细胞转染24～72 h后，阳性转染组细胞HCT116的增殖能力较阴性对照组和空白组明显下降（均P<0.01），而空白组与阴性对照组间差异无统计学意义（均P>0.05），表明干扰NEK2表达可显著抑制结直肠癌细胞的增殖能力，见图4。

图2 NEK2 mRNA(A)和蛋白(B,C)在结直肠癌细胞中的表达Figure 2 Expression of NEK2 mRNA(A) and protein(B,C)in CRC cells

图3 转染si-NEK2或si-CTRL的HCT116细胞中NEK2蛋白表达Figure 3 Expression of NEK2 protein in HCT116 cells transfected with si-NEK2 or si-CTRL

图4 敲低NEK2对结直肠癌细胞HCT116增殖能力的影响Figure 4 Effects of NEK2 knockdown on proliferation capability of HCT116 cells

2.5 敲低NEK2后结直肠癌细胞发生G0/G1期周期阻滞

流式细胞学检测结果显示，与阴性对照组和空白组相比，阳性对照组G0/G1期细胞比例升高，S期比例下降，差异均有统计学意义（均P<0.01），而阴性对照组和空白组间的细胞周期比例差异无统计学意义（P>0.05），见图5。

2.6 敲低NEK2后结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力显著下降

Transwell小室法检测结果显示，阳性转染组的穿膜细胞数明显低于阴性对照组和空白组（（95.67±7.77）vs.（163.00±13.08）、（171.33±13.05），均P<0.01），阴性对照组和空白组间穿膜细胞数差异无统计学意义（P>0.05），见图6A、B；划痕实验结果显示，阳性转染组的划痕愈合率明显低于阴性对照组和空白组（（31.80±4.10）%vs.（70.57±2.32）%、（72.77±3.25）%，均P<0.01），阴性对照组和空白组间划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05），图6C、D。

2.7 敲低NEK2后结直肠癌细胞E-cadherin、N-cadherin、CDK4和cyclin D1的表达情况

Western blot检测结果显示，对比阴性对照组和空白组，细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D1，EMT相关分子标志物N-cadherin在阳性对照组的表达量显著下降（P<0.01），EMT相关分子标志物E-cadherin在阳性对照组的表达量显著升高（P<0.01）。上述蛋白在阴性对照组和空白组间的表达差异无统计学意义（P>0.05），见图7。

图5 敲低NEK2对结直肠癌细胞HCT116周期的影响Figure 5 Effects of NEK2 knockdown on cell cycle of colorectal cancer HCT116 cells

图6 敲低NEK2对结直肠癌细胞HCT116侵袭(A,B)和迁移(C,D)能力的影响Figure 6 Effects of NEK knockdown on invasion(A,B) and migration(C,D) abilities of colorectal cancer HCT116 cells

图7 细胞周期蛋白CDK4和cyclin D1(A,B)，EMT相关分子标志物E-cadherin和N-cadherin(C,D)在结直肠癌细胞HCT116中的表达Figure 7 Expression of CDK4 and cyclin D1(A,B),E-cadherin and N-cadheri n(C,D) in colorectal cancer HCT116 cells

3 讨论

NEK2基因定位于染色体1q32.2～1q41，其表达蛋白是一种与中心体（never in mitosis A，NIMA）有丝分裂调节器结构相似的丝氨酸/苏氨酸激酶，它包含一个N端的催化激酶结构域，C端结构域包含亮氨酸拉链、卷曲螺旋、中心体结合位点、核仁定位和微管结合位点、PP1结合位点和APC结合位点等多种结构基团[7]，NEK2通过结合并磷酸化有丝分裂相关蛋白参与染色体的复制和分离[8]、微管稳定[9]、着丝点附着和纺锤体组装等细胞周期过程[10-11]。近年来研究发现，NEK2异常活化会导致染色体不稳定和染色体包含异常内容，最终导致肿瘤发生[12]。Zhang等[13]研究发现NEK2在肝细胞癌中的表达水平与患者的预后呈负相关，NEK2通过激活Wnt、ΝF-κB、VEGF及P53信号通路介导EMT机制促进了肝癌细胞的侵袭和转移，另有研究表明NEK2可通过活化蛋白激酶磷酸酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路调控HepG2细胞的增殖、凋亡及其他生物学行为[14]。在前列腺癌的研究中，Zeng等[15]发现NEK2在人前列腺癌细胞和原发性前列腺癌组织中表达升高并与患者的Gleason评分及病理分期呈正相关，通过siRNA技术沉默NEK2表达可抑制前列腺癌细胞的体外增殖和异种移植体的体内生长。此外，Kokuryo等[16]也发现NEK2在胰腺癌细胞株中高表达，NEK2 siRNA可抑制胰腺癌皮下移植瘤小鼠模型的肿瘤生长，延长腹腔内移植瘤小鼠模型的生存时间，并利用门静脉导管系统有效地阻止肝转移的进展。以上结果表明，NEK2的异常表达促进了肿瘤的增殖、侵袭和转移，而针对NEK2的siRNA治疗有可能作为肿瘤治疗的一个有效手段。

本研究采用免疫组织化学技术、qRT-PCR和Western blot检测NEK2在结直肠癌组织及细胞中的表达，结果显示NEK2蛋白及mRNA在结直肠癌组织及细胞中高表达，并与结直肠癌TNM分期、淋巴结转移和远处转移相关，提示NEK2可能与结直肠癌的发生发展有关。为探究NEK2在结直肠癌中的作用机制，我们选取结直肠癌细胞HCT116作为研究对象，通过体外瞬时转染NEK2 siRNA抑制HCT116中NEK2 mRNA表达。CCK8实验及流式细胞学检测结果显示，NEK2干扰后，HCT116细胞G1期比例增加，S期比例减低，提示出现G0/G1期阻滞，并且细胞增殖率较对照组显著下降。CDK4是细胞G1/S期转换的关键调控因子，它与细胞cyclin D1形成复合物后可使视网膜母细胞瘤蛋白发生磷酸化失活，驱动细胞周期进展[17]，目前在乳腺癌研究中已发现NEK2与CDK4的表达存在分子连接性[18]。NEK2是否通过与CDK4和cyclin D1的相互作用参与结直肠癌细胞的周期调控，本研究结果显示在NEK2干扰阳性转染组中CDK4和cyclin D1的表达量显著降低，表明NEK2下调可通过改变CDK4和cyclin D1表达量使结直肠癌细胞发生周期阻滞，抑制细胞生长。此外Transwell小室法和划痕实验的检测结果显示，NEK2干扰后HCT116细胞穿膜细胞数及划痕愈合率均显著下降，表明NEK2下调能显著降低HCT116细胞的侵袭转移能力。高度保守的Wnt/β-catenin信号通路在调控胚胎发育、器官形成、组织再生及决定细胞命运方面发挥着重要作用，而多种肿瘤癌基因则通过调控Wnt/β-catenin信号通路使其异常活化促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移[19-21]。在肝细胞癌的研究中发现NEK2的异常活化可改变β-catenin在细胞内定位，进而促进肿瘤细胞EMT进程并获得侵袭性表型[22]。为研究结直肠癌中NEK2表达与EMT机制的关系，本研究通过Western blot检测EMT关键组件E-cadherin和N-cadherin在HCT116细胞中的变化，结果显示敲低NEK2后HCT116细胞E-cadherin蛋白高表达，N-cadherin低表达，表明NEK2在EMT过程中及结直肠癌侵袭转移的肿瘤促进功能上发挥着关键作用，然而NEK2具体通过何种信号通路参与调控EMT进程仍有待进一步的研究。

本研究结果表明，NEK2在结直肠癌组织中高表达，下调NEK2表达可抑制人结直肠癌细胞的增殖及侵袭转移能力，提示NEK2在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要的作用，可作为结直肠癌基因治疗的有效靶点。