液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查与确证紫甘蓝中415种农药残留

谢瑜杰, 陈 辉*, 盖丽娟, 霍思宇, 范春林, 吕美玲

(1. 中国检验检疫科学研究院, 北京 100176; 2. 北京合众恒星检测科技有限公司, 北京 100176; 3. 安捷伦科技(中国)有限公司, 北京 100102)

农药残留是食品安全领域长期关注的问题之一。传统的农药残留主流检测技术有气相色谱-质谱法[1]、气相色谱-三重四极杆质谱法[2-7]和液相色谱-三重四极杆质谱法等[8-14]。随着农药种类的不断增加,目前世界常用农药已经增加到1 100多种[15],传统农药残留检测技术已经不能满足实际检测需求。

高分辨质谱以其精确质量数、高分辨率和不依赖标准品进行定性的优势[16,17],在食品中农药残留高通量筛查方法中得到了广泛应用[18,19]。例如,赵志远等[20]应用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(LC-QTOF/MS)建立281种农药的一级精确质量数据库和二级谱图库,并采用该数据库和谱图库检索的方式,实现了苹果、番茄和甘蓝中281种农药残留的快速筛查。宋伟等[21]应用LC-QTOF/MS建立了204种农药的一级精确质量数据库和二级谱图库,通过化合物的精确质量数、保留时间、同位素比值等信息对检测结果进行自动检索,从而在无对照标准品的情况下实现了204种农药的定性鉴定。在这些方法中,通常需要2次进样筛查,即第一次进样后通过加合离子、保留时间等信息对化合物进行初步筛查,第二次则是针对初筛化合物建立二级采集方法,通过与二级谱图库比对进行化合物确证。尽管这种方式进行农残筛查可以获得较高的灵敏度,但是从快速、高效和节约成本的角度考虑,建立一次进样的筛查方法可以显著提高筛查效率[22]。

全自动MS/MS采集模式(Auto MS/MS)和全离子MS/MS采集模式(All Ions MS/MS)是LC-QTOF/MS中只需要一次进样便可对化合物进行筛查的两种采集模式。在Auto MS/MS模式中,输入加合离子信息和碰撞能后,质谱在一个循环时间内交替对一级质谱和二级质谱进行扫描,根据一级和二级质谱匹配情况对化合物进行确证[23]。在All Ions MS/MS采集模式中,选择多个碰撞能通道进行采集,通过分析各通道化合物共流出的特征,得到加合离子和碎片离子的共流出关系,根据目标物的保留时间、加合离子和碎片离子的精确分子量等信息与数据库进行检索比对,最终对化合物进行确证[24,25]。

紫甘蓝是一种常见的蔬菜,常见于蔬菜沙拉等非加热类菜品中,在其种植过程中通常会施用多种农药。研究表明,紫甘蓝属于碱性蔬菜,其紫红色叶片中色素含量非常丰富,不易净化。紫甘蓝由于自身基质的复杂性,对其残留的农药进行准确筛查的难度相对较大。本文以可筛查农药种数和假阴性农药种数作为指标,考察了Auto MS/MS和All Ions MS/MS两种不同采集模式,最终选择All Ions MS/MS采集模式。然后在选择的采集模式下,建立了基于LC-QTOF/MS的紫甘蓝中415种农药残留快速筛查方法。将该方法应用于2019年能力验证紫甘蓝中农药残留的筛查和定量,对该方法的准确性和可靠性进行了考察和验证。与传统两次采集进行筛查的方法相比,本文建立的一次进样对紫甘蓝中农药多残留进行定性筛查和定量测定的方法,提高了农药残留筛查的效率,可以为水果和蔬菜中农药多残留的快速筛查提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 Infinity II LC-6545 Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪,配有双喷射电喷雾电离源(美国Agilent公司), AH-30全自动均质仪、Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪、高通量真空平行浓缩仪(中国睿科仪器有限公司), SR-2DS水平振荡器(日本Tatec公司), KDC-40低速离心机(安徽中佳公司), N-EVAP 112氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司), Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司), PL602-L电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

415种农药标准品纯度均≥95%(中国阿尔塔科技有限公司);甲酸和乙酸铵均为质谱纯;乙腈、甲苯为色谱纯(美国Fisher公司);乙酸、氯化钠、无水硫酸钠和无水硫酸镁均为分析纯(中国安谱公司); Carbon/NH2柱(美国Agilent公司)。

1.2 标准溶液的配制

称取10 mg(精确至0.01 mg)标准品,置于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度,配制单标准储备液,于-18 ℃避光保存;根据需要,移取适量储备液,用甲醇稀释,配制所需浓度的标准工作液,于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

提取:称取紫甘蓝样品10 g,置于80 mL离心管中,加入1%醋酸乙腈40 mL,以13 500 r/min均质1 min,加入1 g氯化钠、4 g无水硫酸镁,振荡10 min,以4 200 r/min离心5 min,取上清液20 mL,在37 ℃、150 r/min条件下蒸发浓缩至约2 mL,待净化。

净化:在Carbon/NH2柱中加入约2 cm无水硫酸钠,将Carbon/NH2柱放到自动固相萃取仪上。用4 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化SPE柱,并弃去流出液,每次用2 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗涤样液瓶3次,并将洗涤液移入Carbon/NH2柱中。再用25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脱,合并洗脱液,置于试管中。在37 ℃、150 r/min条件下蒸发浓缩至约0.5 mL,并将浓缩液置于氮气下吹干,加入1 mL乙腈-水(3∶2, v/v)混匀,经0.22 μm滤膜过滤后,定容。

1.4 仪器条件

色谱柱:ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱温:40 ℃;流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵), B相为乙腈;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～3 min, 1%B; 3～6 min, 1%～30%B; 6～9 min, 30%～40%B; 9～15 min, 40%B; 15～19 min, 40%～60%B; 19～23 min, 60%～90%B; 23～23.01 min, 90%～1%B; 23.01～27.01 min, 1%B。进样体积:5 μL。

离子源:双通路喷射流电喷雾电离(Dual AJS ESI)源;扫描方式:正离子全扫描;全扫描范围:m/z50～1 000;毛细管电压:4 000 V;雾化气体:氮气;雾化气压力:0.14 MPa;鞘气温度:375 ℃;鞘气流速:11.0 L/min;干燥气流速:12.0 L/min;干燥气温度:325 ℃;碎裂电压:145 V。

All Ions MS/MS模式条件:0 min时,碰撞能为0 V; 0.5 min时,碰撞能分别为0、15和35 V。其他质谱参数见表1。

表 1 415种农药的分子式、保留时间(tR)、加合离子、定量离子和定性离子

表 1 (续)

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表 1 (续)

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表 1 (续)

表 1 (续)

2 结果与讨论

2.1 高分辨质谱数据库的建立

2.2 采集模式的选择和参数优化

在基于QTOF/MS的高分辨质谱中,要实现同时采集获取一级质谱和二级质谱信息,可以通过两种方式实现。一种是数据依赖的采集模式,如Auto MS/MS采集模式;另外一种是数据非依赖的模式,如All Ions MS/MS采集模式。本文分别对两种模式下的参数进行优化,并在各自最优的条件下进行比较。

2.2.1Auto MS/MS采集参数的优化

Auto MS/MS采集模式中,可以允许系统根据质谱图中m/z的响应强度来自动选择母离子进行二级质谱扫描,同时允许对指定化合物列表优先进行二级质谱扫描。为了保证优化效果,本文根据农药化学性质分类,选择PCDL库中的214种农药放入指定列表,并在其相应的保留时间窗口优先采集其二级质谱图。在固定标准混合溶液质量浓度为100 μg/L条件下,对Auto MS/MS采集模式的参数进行优化。结果显示,在固定一级质谱采集速率下,随着二级质谱采集速率从2 spectra/s增加到6 spectra/s,筛查出的农药占比逐渐下降,同时假阴性农药的占比逐渐增加,采集速率为2 spectra/s时的筛查结果相对最佳,筛查出农药占比可以达到79.91%。因此,在采用Auto MS/MS模式时,二级采集速率建议设定为2 spectra/s，以尽可能提升检出的农药占比,降低假阴性率。

2.2.2All Ions MS/MS优化

数据非依赖的All Ions MS/MS模式是近年来发展起来的一种高效采集模式,采集时无需事先设置加合离子信息,可以针对采集的数据,依据保留时间、加合离子和二级碎片离子的共流出轮廓匹配情况对化合物进行定性。因此,至少需要高低两个能量通道以满足定性和定量数据的同时采集。碰撞能和采集速率是影响All Ions MS/MS采集模式性能的重要参数,本文分别对二者进行了优化。

实验首先对碰撞能进行了优化。在All Ions MS/MS模式中需要设置碰撞能0 V以获得化合物的加合离子信息,设置0 V以上的碰撞能以获得二级质谱的信息。本实验选择前述214种代表性农药进行碰撞能优化。碰撞能较低时,采集到的碎片离子较少,用于定性的离子可能会偏少,导致定性信息不充分。如果碰撞能较高,化合物的主要定性离子强度降低,同时相对分子量较低的碎片离子增加,而基质中的干扰峰通常位于低相对分子质量端,这会对化合物的定性产生干扰。因此,本文在固定采集速率为2 spectra/s的条件下,对比了在0 V和15 V双碰撞能通道下和0、15和30 V三碰撞能通道下,以及0、15和35 V三碰撞能通道下采集所筛出农药和假阴性农药的占比情况(见图1)。可以看出,在0、15和35 V三碰撞能通道下,可筛查出农药的占比明显高于其他情况,这主要是因为,同时在0、15和35 V三碰撞能通道下采集,可以使得一些相对稳定的化合物产生相对较强的二级碎片离子,有助于对化合物进行同时基于母离子和二级碎片离子的准确定性。

图 1 不同碰撞能下准确筛查出的农药和假阴性农药占比Fig. 1 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different collision energies

在选定的0、15和35 V三碰撞能通道下,针对这214种农药,对采集速率进行优化。图2给出了2、3、4、5和6 spectra/s等5种采集速率下,筛出农药和假阴性农药的占比情况。从图2可以看出,对于采集速率2、3和4 spectra/s,随着采集速率的增加,可筛查出的农药占比增加,采集速率为4 spectra/s时,所有农药均能筛出,但是当采集速率设置为5 spectra/s和6 spectra/s时,可筛出农药数量的占比有所下降。同时,由于在All Ions MS/MS模式中两个通道交替采集,采集速率逐渐增加,每个采集点的扫描时间下降,使得加合离子的响应逐渐下降,在保证每个色谱峰采集点数满足准确定量的前提下,采集速率为4 spectra/s时的筛查结果最佳。

图 2 不同采集速率下准确筛查出的农药和假阴性农药占比Fig. 2 Percentage of accurately screened and false-negative pesticides using different acquisition rates

2.2.3不同采集模式的比较

在Auto MS/MS和All Ions MS/MS两种采集模式的最佳条件下,分别对214种农药的筛查情况进行比较。结果表明,214种农药在All Ions MS/MS采集模式下的筛出农药数量占比为100%,远高于在Auto MS/MS采集模式下的检出率(79.91%)。结合前述分析,Auto MS/MS采集模式下的筛出农药占比均低于All Ions MS/MS采集模式任一碰撞能下的检出率,说明All Ions MS/MS采集模式更加灵敏,假阴性率明显降低,优于Auto MS/MS采集模式。因此,本文选择All Ions MS/MS采集模式中0、15和35 V三碰撞能通道和采集速率4 spectra/s作为最佳条件,建立紫甘蓝中415种农药的高通量筛查方法。

2.3 方法学验证

2.3.1线性范围、筛查限与定量限

称取6份空白紫甘蓝样品,按1.3节描述进行前处理后,分别加入不同浓度的混合标准工作液,建立基质匹配标准曲线。应用All Ions MS/MS模式测定目标化合物,以加合离子的质量浓度对其峰面积绘制标准曲线,415种农药在各自范围内线性关系良好,相关系数(r2)均高于0.990(见附表1,详见http://www.chrom-China.com/)。

关于筛查限(SDL)的确定,参照欧盟指南文件SANTE/12682/2019的要求,在一系列浓度水平上做添加回收试验，每个水平制备20个平行样,按照1.3节描述进行前处理后进行检测。如果在某添加水平下,某个化合物在19个紫甘蓝样品中均能被定性筛查出来,则该浓度被确定为该化合物在紫甘蓝中的筛查限。附表1给出了415种农药的筛查限,为1～20 μg/kg,其中411种农药的筛查限小于等于5 μg/kg。

按照1.3节描述对紫甘蓝样品进行前处理,向空白样品中添加不同水平的目标化合物,在前述最佳条件下进行测定,以信噪比S/N≥10对应的添加水平作为定量限(LOQ),结果见附表1,紫甘蓝中415种农药的定量限为1～20 μg/kg,其中413种农药的LOQ≤10 μg/kg。

2.3.2回收率与精密度

为了考察方法的准确度和精密度,对空白紫甘蓝样品进行添加回收试验。分别选择1倍、2倍和10倍LOQ的混合标准工作液作为添加水平,按前述方法进行前处理,每个添加水平制备5个平行样品。同时进行空白实验,扣除本底值后计算添加回收率和相对标准偏差。紫甘蓝中415种农药在1倍、2倍和10倍LOQ添加水平下的回收率分别为65.7%～118.4%、72.0%～118.8%和70.2%～111.2%,相对标准偏差分别为0.9%～19.7%、0.2%～19.9%和0.6%～19.9%,结果见附表1。说明该方法的准确度和精密度满足准确定量的要求。

2.4 欧盟能力验证样品测定

2019年欧盟组织了紫甘蓝中农药残留检测的能力验证,包括定性筛查(EUPT-SM-11)和定量筛查(EUPT-FV-21)两方面内容。将本文建立的筛查方法应用于该能力验证项目提供的紫甘蓝样品中农药残留的定性筛查和准确定量,评估了该方法的定性可靠性和定量准确性。样品前处理按照1.3节描述进行,用All Ions MS/MS模式在最佳参数条件下进行数据采集。

定性筛查EUPT-SM-11未给定紫甘蓝样品中添加农药的范围,重点考察筛查出农药的种类,定量仅做参考,而且要求收到样品72 h内上报结果。结果显示,本实验室应用本文开发的方法筛出了添加的16种农药,没有假阳性结果。与欧盟官方最终公布结果完全一致。

关于定量筛查EUPT-FV-21,组织方提供了强制和自愿农药清单,要求首先对紫甘蓝中在清单范围内的农药进行筛查,再对筛查出的农药准确定量。要求检测范围覆盖强制农药清单的90%,检出所添加农药种类的90%或以上并能准确定量,并且不能出现假阳性结果。

应用本文建立的方法首先进行定性筛查,准确筛查出了其中可以采用基于液相色谱-质谱技术检测的19种非挥发性农药,并采用相应的标准品进行进一步的准确定量。结果表明,本文建立的紫甘蓝中农药多残留筛查方法定性能力强,没有假阳性,而且定量结果准确可靠,所有筛查出的化合物的定量结果均在验证样品的标准值允许误差范围内。

3 结论

通过对比不同采集模式,优化采集参数,本文应用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱建立了紫甘蓝中415种农药残留的高通量定性筛查与准确定量方法。将该方法应用于2019年欧盟组织的紫甘蓝中农药残留能力验证,结果表明,基于All Ions MS/MS采集模式的一次进样便可快速定性和定量的方法,具有非常强的定性筛查能力,同时可以对筛查出的化合物进行准确定量。该方法具有简单、快速的特点,适用于对紫甘蓝中多种农药残留的快速筛查,可以为其他水果蔬菜中农药残留的高通量筛查提供参考。