不同荧光染料对3种储存温度下血小板的标记效果*

陆 英， 袁 青， 邝丽华， 赵才翰， 张祥忠

（中山大学附属第三医院 1输血科，2血液科，广东广州510630）

血小板输注用于预防和治疗因血小板数量减少或者功能异常导致的出血，是临床上挽救生命的重要治疗手段之一。目前血小板普遍采用在血小板震荡仪于室温（20～24℃）中保存，保存期为3～7 d 不等，我国血小板的室温保存期为5 d［1］。由于血小板的保存时间短，因此临床上时常存在血小板供不应求的情况。那么如何延长血小板的保存期是大家长期以来研究的科学问题。4℃和冷冻保存法是研究比较多的2种方法［2-4］。

比较不同温度储存血小板功能的实验，比如体外灌注法研究血小板血栓的形成［5］，实时观察血小板在体内止血过程等［6］，通常需要先用荧光标记物标记好血小板，然后再在荧光显微镜下观察并拍摄图像，最终通过计算机分析图像的荧光强度来比较不同温度储存下血小板功能的差异。由于荧光强度是分析结果的依据，因此必须保证实验所用的荧光标记物对不同温度下保存的血小板具有相似的标记效果。本研究比较5-氯甲基荧光素二乙酸酯（5-chloromethylfluorescein diacetate，CMDFA）、碘代3，3'-二己氧基羰花青［3，3′-dihexyloxacarbocyanine io⁃dide，DiOC6（3）］及抗血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ibβ抗体衍生物（anti-GPIbβ derivative）标记不同温度下储存的血小板的效果，以期找出一种受温度因素影响较小的血小板荧光标记物。

材料和方法

1 试剂

Annexin V-Alexa Fluor 647 购自Biolegend；兔抗小鼠CD62P抗体购自BD；Cell TrackerTMCMFDA Dye购 自Thermo Fisher Scientific；DiOC6（3）Dye 购 自AAT Bioquest；抗GPIbβ抗体衍生物购自Emfret。

2 血小板的获取和保存

C57 小鼠购自广东省医学实验动物中心。眼眶静脉取血法获取15 只C57 小鼠的全血，300 ×g 离心7 min，分离出上层的富血小板血浆，计数血小板，调整血小板浓度为1×1012/L。室温组置于20～24℃的血小板震荡仪保存，震荡的速率为每分钟60次。4℃组置于4℃冰箱（无震荡）保存。冷冻组血小板加入6%的DMSO 置于-80℃冰箱保存。3 组血小板保存24 h后用于染色实验。

3 实验方法

3.1 血小板凋亡和活化率的检测 冷冻组血小板在37℃水浴箱中解冻。室温和4℃存储的血小板及解冻后的血小板采用800×g 离心8 min，去上清，用PIPES 缓冲液重悬。分别从3 组中取适量血小板加入200 μL 的PIPES 液，使血小板的终浓度为1×109/L，加入Annexin V 或者抗CD62P 抗体，孵育20 min，置于流式细胞仪（BD，LSR FortessaX-20）上机检测

3.2 CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ抗体衍生物对血小板染色效果的检测 PIPES 液重悬的每组血小板各分为3 等份，分别加入CMFDA、DiOC6（3）及抗GPIbβ 抗体衍生物染色，使终浓度分别为5 μmol/L、2 μmol/L 和2 μmol/L。染色30 min 后离心、洗涤，从各组血小板取适量用PIPES 液重悬，使血小板浓度为1×109/L，于流式细胞仪上机检测。

4 统计学处理

所有数据分析采用软件SPSS 17.0 完成。数据采用均数±标准差（mean±SD）进行描述，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较，并用Bonferron 法进行多重比较。假设检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CMFDA和DiOC6（3）的对血小板的标记效果

CMFDA 对室温、4℃和冷冻血小板的标记阳性率 分 别 为（97.67±1.56）% 、（98.33±1.85）% 和（69.43±6.35）%，DiOC6（3）的阳性率则分别为（98.67±1.53）%、（99.40±0.53）%和（83.63±10.01）%；室温、4℃和冷冻血小板CMFDA 的平均荧光强度（mean flu⁃orescence intensity，MFI）分别为8 405±1 350、8 342±1 256 和1 398±167，DiOC6（3）的MFI 则 分 别 为45 346±3 766、43 999±3 229 和5 187±201，见图1。与前两组相比，冷冻血小板CMFDA 和DiOC6（3）染色的阳性率及MFI 均显著降低（P＜0.05），表明CMFDA和DiOC6（3）对冷冻血小板的标记效果差于室温组和4℃组。

2 室温、4℃和冷冻血小板的凋亡以及活化率

室温、4℃和冷冻组血小板凋亡率分别为（2.463±1.320）% 、（2.317±1.412）% 和（54.700±9.042）%，与前两组相比，冷冻组血小板的凋亡率显著增加（P＜0.01）；3 组血小板CD62P 的阳性率分别为（8.158±3.582）%、（8.070±4.478）%和（31.950±12.380）%，冷冻组血小板CD62P 的阳性率大于室温和4℃组（P＜0.01）。3 组血小板CD62P 的MFI 则分别为298±10.75、294.3±14.64 和428.8±45.07，冷冻血小板CD62P 的MFI 明显大于前两者（P＜0.01），见图2。上述结果表明，冷冻血小板的凋亡和活化率显著高于室温和4℃组。

Figure 1. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of CMFDA and DiOC6（3）in the platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of CMFDA；B：positive percentage of DiOC6（3）；C：MFI of CMFDA and DiOC6（3）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs frozen group.图1 CMFDA和DiOC6（3）对室温、4℃和冷冻血小板标记的阳性率和MFI的比较

3 抗GPIbβ抗体衍生物的标记效果

抗GPIbβ 抗体衍生物对室温、4℃和冷冻血小板标 记 的 阳 性 率 分 别 为（95.30±3.23）%、（95.30±3.28）%和（95.17±3.45）%；MFI 则分别为5 247±423、4 938±785和4 867±662，3组之间的差异无统计学显著性（P＞0.05），见图3。上述结果表明，抗GPIbβ抗体衍生物对3组血小板的标记效果相似。

讨 论

22℃震荡保存是目前临床上普遍应用的血小板保存方法，然而其保存期只有几天。为延长保存期，许多实验致力于4℃和冷冻血小板存储的研究。血小板在储存过程中会出现血小板储存损伤（platelet storage lesion，PSL），表现为细胞形态改变、细胞表面抗原减少、细胞器功能受损、细胞内代谢水平变化等［7-8］。不同储存温度下血小板的PSL 程度不一，凋亡和活化是血小板PSL 的重要表现，血小板内部的一些细胞器例如线粒体、各种酶类的功能会随着凋亡和活化程度的增加而降低。

在比较不同温度保存的血小板的止血功能时，最好的途径是能实时观察血小板在体内的止血过程。而临床上往往只是通过观察患者出血情况的变化来判断止血功能的，很难实时观察患者体内的止血过程，因此目前研究血小板体内止血的实验主要在动物体内实施［6］，此研究需要有效的血小板的标记方法。标记血小板的最常用方法包括基因工程技术导入荧光基因以及荧光染料标记血小板；后者又可以分为两类：一是血小板特异性荧光染料，即带有荧光染料的血小板抗体，另外一类是血小板非特异性染料，包括多种荧光素，它们能与多种细胞结合。荧光基因标记法操作比较繁琐，实验要求较高，而且有研究表明转染荧光基因的动物的血小板功能有不同程度的变化［9］。

Figure 2. Apoptosis and activation of platelets preserved in room temperature（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of Annexin V；B：positive percentage of CD62P；C：mean fluorescence intensity（MFI）of CD62P. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs frozen group.图2 室温、4℃和冷冻存储下血小板凋亡和活化程度的比较

本研究试图为室温、4℃及冷冻存储的血小板寻找出一种合适的荧光标记物，此标记物必须对3 种温度保存的血小板标记效果相似，因此，血小板特异性荧光染料应该是针对基本不受温度影响的血小板表面抗原，而血小板非特异性染料也应该是针对受温度影响很小的细胞器、蛋白基团和酶类等等。本研究比较了CMDFA 和DiOC6（3）两种血小板非特异性荧光染料和抗GPIbβ 抗体衍生物血小板特异性荧光染料的标记效果。

CMDFA 含有能与硫醇反应的氯甲基，在细胞内通过酶的作用转变为具有荧光的物质，此产物能经过细胞分裂传递给子细胞，但是不能转移到相邻细胞。CMFDA 染色细胞是目前常用的细胞评价方法，具有方便、准确、灵敏等优点［10］。许多实验研究用CMFDA 标记各种类型的细胞，例如果蝇精子、血小板、红细胞、内皮细胞、肿瘤细胞的研究［11-12］。CMFDA 无细胞毒性，不影响细胞的活力和增殖［13］。DiOC6（3）是一种阳离子亲脂性荧光染料，可用于线粒体、细胞内质网和囊泡膜的荧光标记，其信号可以通过荧光显微镜或流式细胞术进行监测［14］。DiOC6（3）可应用于多种细胞的荧光标记，比如淋巴细胞、血小板和肺癌细胞，未见其相关细胞毒性的报道［15-16］。当线粒体功能受损导致其线粒体膜电位降低时，细胞对DiOC6（3）的摄入就会减弱，表现为荧光强度降低［16］。抗GPIb 抗体衍生物是抗小鼠血小板/巨核细胞表面GPIb-V-IX 复合物上的亚单位——GPIbβ 的抗体衍生物。与一般抗GPIb 抗体相比，该抗体经过修饰改良，能够稳定标记体内循环血小板，而且在推荐剂量范围内，抗GPIbβ 衍生物没有毒性，不干扰体内血小板黏附和聚集，用于分析体内循环血小板的功能［6，17］。

Figure 3. Positive percentage and mean fluorescence intensity（MFI）of anti-GPIbβ derivative in platelets preserved in room tempera⁃ture（RT），4℃and frozen state. A：positive percentage of anti-GPIbβ derivative；B：MFI of anti-GPIbβ derivative.Mean±SD. n=3.图3 抗GPIbβ抗体衍生物对室温、4℃和冷冻血小板标记的阳性率和MFI的比较

本研究中，荧光染料标记结果显示CMFDA 和DiOC6（3）两种染料对冷冻组血小板的标记效果明显差于室温组和4℃组。CMFDA 本身无荧光，进入细胞后可能通过一种叫谷胱甘肽S-转移酶的酶类的作用而转变为有荧光的物质，所以CMFDA 荧光的强度可以反映细胞的活力［12，18］。我们实验结果表明冷冻血小板的CD62P 以及Annexin V 阳性率分别高达（31.95±12.38）%和（54.70±9.04）%，说明血小板活化率以及凋亡率很高［19］，这种状态下血小板的活力大大降低，因而，其对CMFDA 的着色能力也大大降低。这与Wang 等［10］的研究的相似，他们发现室温储存的血小板，随着保存时间的延长，血小板的凋亡以及活化率增加，CMFDA 的着色效果则逐渐降低。DiOC6（3）是主要用于线粒体染色的荧光染料，随着凋亡程度的增加其荧光强度减弱，冷冻血小板的凋亡率很高，因此可表现为对DiOC6（3）的着色效果明显低于液态保存的血小板。

血小板在活化的过程中可以出现多种蛋白的脱落，其中GPIbα 和GPVI 的脱落就是非常典型的例子［20］。Fong 等［21］从活化的血小板上清液中鉴定出1 048种蛋白，其中69种为带有一个或者多个跨膜域或者一个糖基磷脂酰肌醇I 锚定的血小板膜蛋白。GPIbβ 是血小板糖蛋白GPIb 的组成亚基之一，2 个GPIbβ和1个GPIbα构成了GPIb，有研究报道冷冻血小板表面的GPIbα 显著减少［22］，这与冷冻血小板活化增加导致GPIbα 脱落有关。我们的实验发现，尽管冷冻组血小板的活化率增高，抗GPIbβ 抗体衍生物对室温、4℃和冷冻组的染色效果相似，说明温度对血小板表面GPIbβ 的影响很小。因此，抗GPIbβ抗体衍生物可考虑作为荧光标记物应用于比较室温、4℃和冷冻保存血小板功能的相关实验。