伊曲茶碱中间体杂质的分离与鉴定

王宜运, 吕晓芳, 徐豪杰, 孟子晖*, 李加荣, 徐志斌, 薛 敏

(1.北京理工大学化学与化工学院,北京 102488;2.山东新华制药股份有限公司,山东 淄博 255086)

帕金森氏病(PD)是老年人的神经退行性疾病。该疾病主要导致运动障碍,如静息性震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和步态异常,以及非运动性症状,如肌张力低下、睡眠障碍、焦虑和抑郁[1,2]。PD影响世界各地的数百万人。中国有超过250万PD患者。研究表明,PD的发病率会随着年龄的增长而显著增加,到2030年,PD的患者数量可能会增加一倍[3,4]。目前,尚未发现可以逆转或治愈PD的确切药物和相应疗法。因此,如何有效地延迟PD的进程是当前亟待解决的问题。PD的治疗主要是临床对症治疗为主,以康复治疗为辅,其中药物治疗是主要治疗手段[5,6]。左旋多巴(L-dopa)是控制PD的非常有效的代表性药物,但长期大量服用左旋多巴常伴有药物运动型并发症剂末现象,导致PD症状加重或者恶化[7,8]。

由日本的Kyowa Hakko Kogyo公司研发的伊曲茶碱((E)-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯基)-1,3-二乙基-7-甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮,见图1)是一种新型选择性腺苷A2A受体拮抗剂,通过激活丘脑底核的γ-氨基丁酸(GABA)能通路,改善患者的运动症状[9]。

图 1 伊曲茶碱的化学结构Fig.1 Chemical structure of istradefylline

伊曲茶碱于2013年3月在日本上市,作为左旋多巴/卡比多巴的辅助疗法,能明显缩短关期,延长开期,可显著降低左旋多巴治疗的剂末现象[10-13]。与其他抗PD药物相比,伊曲茶碱具有较小的副作用,在克服多巴胺药物的某些缺陷上具有显著作用,因此在治疗PD方面具有广阔的前景[14]。

伊曲茶碱的上市在PD患者的药物治疗上又迈出了成功的一步,但在伊曲茶碱的合成过程中,发现其中还存在一些未知杂质,这些杂质的存在会对药物活性带来一定的影响,对安全性带来一定的风险。因此鉴定和减少药物中的杂质非常必要,可以保证药物的有效性和安全性[15,16]。目前高效液相色谱(HPLC)是最常用的杂质检测方法之一[17,18]。

在伊曲茶碱合成中,中间体A1(6-氨基-1,3-二乙基-2,4-(1H,3H)-嘧啶二酮)是其中一个关键中间体,由1,3-二乙基脲与氰基乙酸经缩合、环合反应制得[19](见图2)。

图 2 中间体A1合成路线Fig.2 Synthetic route of intermediate A1

图 3 (E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺的结构Fig.3 Structure of (E)-N-ethyl-2-cyano-3-ethylamino-2-butene amide

在我们前期的研究中,中间体A1的一个杂质已经被鉴定出并进行了表征,如图3所示,其结构被鉴定为(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺,此为中间体A1的降解杂质[20]。在对合成过程中的关键参数进行研究和分析时,发现A1中还存在另外一个未知杂质。因此,我们继续展开研究以确定其结构,并对其进行鉴定及表征。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪:配备SPD-10 Avp检测器的LC-20AD系统(日本Shimadzu);制备型高效液相色谱仪:KNAUER-AZURA HPLC系统(德国Knauer);高分辨率质谱(HRMS):1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-TOF(美国安捷伦),其中ESI为正离子模式。核磁共振(NMR)分析仪:Bruker AⅧ 600 M(美国Bruker);单晶衍射仪:Bruker-apex2 X射线衍射仪(美国Bruker)。

伊曲茶碱中间体:山东新华制药股份有限公司(中国淄博)生产;色谱级乙腈、二甲基亚砜(DMSO)购自德国Merck;水通过Milli-Q水净化系统(美国Millipore)进行净化。

1.2 样品制备

称取0.4 g中间体A1放入50 mL的烧杯中,依次加入8 mL水、8 mL乙腈,超声溶解,然后通过0.45 μm有机膜过滤,得到测试样品溶液。

1.3 HPLC条件

分析型HPLC Agilent Zorbax C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:35 ℃;流动相:乙腈(A)和水(B);流速:1.0 mL/min;梯度洗脱(tmin/A∶B)=t0/20∶80,t15/60∶40,t20～t50/90∶10;检测波长:268 nm。

制备型HPLC Ceres B制备柱(250 mm×30 mm,7 μm);流动相:乙腈-水(30/70,v/v);流速:30 mL/min;检测波长:268 nm。

1.4 核磁共振、质谱分析条件

NMR:将样品(氢谱:1 mg;碳谱:10 mg)放入清洁干燥的样品管中,加入1 mL DMSO溶解后将样品管密封好。将样品管插入转子,调整样品管的高度,样品管插入深度与量筒的底部相平。将转子按序列放入进样器,设置样品检测参数,开始测试。测试完成后,对图谱进行处理。

HRMS:将样品(10 mg)加入25 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,用0.22 μm的有机滤膜过滤,得到样品,备用。设置参数,进样,开始测试。测试完成后,对图谱进行处理,分析检测结果。

1.5 单晶X射线衍射条件

单晶制备:于50 mL单口瓶中加入1 g伊曲茶碱中间体A1、20 mL乙醇,搅拌加热至回流,待完全溶解,关掉热源,冷却至室温后,继续搅拌析晶2 h。抽滤干燥得伊曲茶碱中间体A1晶体。

检测条件:Mo-Kα辐射(λ=71.073 pm),296 K。

2 结果与讨论

2.1 杂质分析

通过高效液相色谱对伊曲茶碱中间体A1进行有关物质分析,在保留时间6.82 min和20.22 min处有两个较大的杂质峰(见图4)。在前期的研究[20]中,保留时间20.22 min处的杂质已经被鉴定出并进行了表征,保留时间6.82 min处杂质需要进一步分离、鉴定。

2.2 制备型HPLC分离、制备杂质

在1.3节制备型HPLC色谱条件下分离中间体A1及相关物质。从图5可以看出,中间体A1和杂质分离度较好，收集保留时间为5.80 min处的馏分(经薄层色谱及分析型HPLC分析确定为目标物),然后用二氯甲烷萃取,减压浓缩,干燥,得到淡黄色物料。

图 5 中间体A1相关物质的制备HPLC图Fig.5 Preparative HPLC chromatogram of intermediate A1 and its relative substances

2.3 杂质的表征

从图6可以看出,杂质的HRMS图显示了质子化分子[M-H]-在m/z253.19处,与中间体A1的质谱(m/z183.100 8)明显不同。

图 6 杂质的HRMS图Fig.6 HRMS spectrum of the impurity

杂质的NMR光谱图见图7。

图 7 杂质的(a)1H NMR谱和(b)13C NMR谱Fig.7 (a) 1H NMR spectrum and (b) 13C NMR spectrum of the impurity

图 8 杂质的(a)HSQC和(b)HMBC NMR谱图Fig.8 (a) Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) and (b) heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) NMR spectra of the impurity

杂质1H-NMR:1H-NMR (600 MHz,DMSO):δ1.01 (q,J=6.9 Hz,3H),1.02 (q,J=6.9 Hz,3H),1.07 (t,J=6.9 Hz,3H),3.04 (p,J=6.8 Hz,2H),3.74 (q,J=7.0 Hz,2H),3.94 (q,J=7.1 Hz,2H),5.85 (s,1H)。

杂质13C-NMR (150 MHz,DMSO):δ13.9,14.1,15.9,34.6,34.9,36.9,81.9,152.2,153.3,159.3,162.0。

基于上述表征,该杂质比中间产物A1多一个甲基和一个亚甲基,杂质的分子骨架具有11个碳,这与具有8个碳的A1的分子骨架不一致。因此,可以得出结论,杂质是中间产物A1的副产物。

为了进一步确定杂质的结构,使用异核单量子相干谱(HSQC)和异核多碳相关谱(HMBC)(见图8)来表征氢和碳。根据HSQC,H(δ1.02)与H-5(δ3.74)相关,并且与C-6(δ13.9)相关,因此被确认为H-6。H(δ1.01)与H-10(δ3.04)相关,并且与C-11(δ15.9)相关,被确认为H-11。H(δ1.07)与H-7(δ3.94)相关,并且与C-8(δ14.1)相关,被确认为H-8。H(δ3.74)与H-6(δ1.02)相关,并且与C-5(δ34.9)相关,被确认为H-5。H(δ3.04)与H-11(δ1.01)相关,并且与C-10(δ34.6)相关,被确认为H-10。H(δ3.94)与H-8(δ1.07)相关,并且与C-7(δ36.9)相关,已确认为H-7。H(δ5.85)与C-3(δ81.9)相关,被确认为H-3。

根据化学位移和相应的氢光谱,杂质的结构包含3个伯碳、3个仲碳、1个叔碳和4个季碳。在HMBC光谱中,伯碳峰(δ15.9)与H-11(δ1.01)相关,而与H-10(δ3.04)远程相关,因此是甲基C-11。C(δ14.1)与H-8(δ1.07)相关,而与H-7(d3.94)远程相关,为甲基C-8。C(δ13.9)与H-6(δ1.02)相关,而与H-5(δ3.74)远程相关,因此为甲基C-6。根据HMBC光谱,仲碳峰(δ36.9)与H-7(δ3.94)相关,而与H-8(δ1.07)远程相关,因此被确认为亚甲基C-7。C(δ34.9)与H-5(δ3.74)相关,而与H-6(δ1.02)远程相关,被确认为亚甲基C-5。C(δ34.6)与H-10(δ3.04)相关,而与H-11(δ1.01)远程相关,为亚甲基C-10。叔碳峰(δ81.9)与H-3(δ5.85)相关,与HMBC光谱无关,已确认为C-3。季碳峰(δ162.0)与HMBC谱图中H-7(δ3.94)远程相关,确认为C-4。HMBC谱显示C(δ159.3)与H-10(δ3.04)密切相关,确认为C-9。C(δ153.3)与H-7(δ3.94)和H-5(δ3.74)密切相关,确认为C-1。C(δ152.2)与H-5(δ3.74)远程相关,被确认为C-2。综上所述,推测该结构为1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氢嘧啶-4-基)-3-乙基脲(见表1)。

表1 杂质的HSQC和HMBC核磁共振数据Table 1 HSQC and HMBC NMR data of the impurity

为了进一步验证和确定物质的空间结构,用单晶X射线衍射对分离出的杂质进行了表征,表征结果见表2。通过数据分析及单晶衍射结构(见图9)分析,进一步确定其结构为1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氢嘧啶-4-基)-3-乙基脲。

表2 杂质的晶体数据Table 2 Crystal data for the impurity

图 9 杂质的单晶X射线衍射结构Fig.9 Single crystal X-ray diffraction structure of the impurity

2.4 杂质的形成机理

在合成中间体A1时使用的原料是过量的,因此我们推断杂质的形成机理可能如下:氰基乙酸与二乙基脲、乙酸酐进行缩合反应得到中间体A1的过程(见图2)中,过量的二乙基脲继续与A1发生酰胺化反应生成1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氢嘧啶-4-基)-3-乙基脲,即生成了此杂质(见图10)。此杂质为中间体A1副产物,与前期研究[20]中发现的中间体A1降解杂质(E)-N-乙基-2-氰基-3-乙氨基-2-丁烯酰胺形成机理虽然不同,但同样都是在高温条件下形成的。

图 10 推测的杂质反应机理Fig.10 Speculated reaction mechanism of the impurity

3 结论

本研究采用制备型HPLC分离伊曲茶碱中间体A1中的杂质。通过HRMS、NMR、2D NMR和单晶X射线衍射分析,杂质结构确定为1-(1,3-二乙基-2,6-二氧-1,2,3,6-四氢嘧啶-4-基)-3-乙基脲。推测其反应机理为:由于在碱性条件下或高温下合成中间体A1时过量的二乙基脲而产生了中间体A1的副产物。该杂质的结构可能会对伊曲茶碱的安全性和有效性产生影响。为了确保伊曲茶碱的质量,在生产过程中需要对该杂质的含量进行控制。

致谢 感谢辽宁双士利制药技术有限公司提供2D NMR服务。